论文摘要
我室前期的工作证明热刺激之后小麦胚芽鞘表皮细胞内的钙离子浓度明显升高,热激还促进钙调素（CaM）基因的表达和CaM蛋白在细胞中的积累,并且钙、钙调素可明显影响热激转录因子（HSF）与热激元件（HSE）的结合活性、热激基因的表达、热激蛋白的积累以及作物耐热性。在模式植物拟南芥中:热激能引起细胞内钙离子浓度和CaM基因表达的明显上升;并且Ca2+和CaM可明显提高热激蛋白的表达水平。拟南芥中不同亚型的CaM对热激的响应研究表明,热刺激之后AtCaM3和AtCaM7的表达有明显升高,而且AtCaM3的表达先于AtCaM7和HSP18.2,这一结果暗示AtCaM3很有可能参与了热激信号转导。最近的研究结果表明:钙调素结合的蛋白激酶AtCBK3是热激信号由CaM传递到HSF的重要一环:in vivo和in vitro的证据证明AtCBK3和AtHSFA1之间的相互作用;CaM激活的AtCBK3可以使AtHSFA1发生磷酸化;AtCBK3的缺失突变体株系、过表达株系分别表现为植物耐热性的缺陷和提高。另一方面在拟南芥中,钙调素结合的蛋白磷酸酶AtPP7也有可能参与了热激信号由CaM到HSF的转导过程:in vitro实验表明AtPP7与CaM及HSF均可以结合;AtPP7的缺失突变体表现为其耐热性下降,然而过表达AtPP7后则可以明显提高转基因植株的耐热性。以上实验结果显示AtCBK3、AtPP7均是热激信号转导途径中CaM下游的重要成员。根据我室多个层次不同水平的研究结果表明钙-钙调素参与了热激信号转导,我们认为在植物细胞内存在一条新的热激信号转导途径:钙-钙调素途径,并提出了Ca2+、CaM参与的热激信号转导途径中上、下游关系的模式图:热激被细胞表面某种受体感受,引起胞内Ca2+浓度升高,Ca2+激活CaM并促进CaM基因的表达,活化的Ca2+-CaM可以与AtCBK3、AtPP7发生相互作用并使之活化,活化的AtCBK3、AtPP7可以通过磷酸化或去磷酸化作用调节HSF的活化状态进而调控热激基因的表达。通过我们的研究,热激信号转导的中、下游的组分及作用机制比较清晰了,那么热激反应的原初反应是如何进行的呢?即热信号是通过什么机制使植物细胞内钙离子浓度升高的呢?根据预备实验结果,我们推测有两种可能的途径:一热激引起的胞内钙库动员,二热激引起的胞外钙库的动员。本研究论文的研究工作即围绕着这两条可能通路而展开。一方面,本论文研究结果发现:在植株受到热刺激之后,拟南芥细胞内的三磷酸肌醇（IP3）的含量有明显的升高,且这个过程非常迅速,大约在五分钟内完成;利用水母发光蛋白测钙法确定了三磷酸肌醇-磷脂酶C（IP3-PLC）信号系统与热激引起的Ca2+升高之间的关系,结果表明IP3-PLC部分的介导了热激引起的胞内Ca2+升高的过程;接下来含有AtHSP18.2 promoter::GUS融合基因的转基因拟南芥被用于检测IP3、PLC活性的抑制剂U73122与热激蛋白积累之间的关系,结果表明IP3在非热激条件下可以促进HSP18.2的表达,这证明IP3-PLC参与了热激蛋白的积累过程。为了进一步了解IP3-PLC在热激信号转导中的作用,通过realtime PCR的方法检测了拟南芥基因组中PLC六个亚型在热激后的表达情况,发现PLCa、PLCb在热激后mRNA含量变化最为明显;通过构建35S::C2（PLCb）-YFP-PAVA321瞬时表达载体转化洋葱表皮观察C2结构域的定位情况,在正常生长条件YFP的荧光大多分布于细胞的质之中,而在热激处理后YFP的荧光定位发生了明显的变化,这暗示热激处理可以使C2结构域发生功能性的定位转移,这为PLCs参与热激信号转导过程提供了更为有力的证据。另一方面,本论文从研究细胞膜钙离子通道入手,采用了膜片钳技术对细胞膜上钙离子通道进行电生理的研究。以拟南芥根组织的伸长区的表皮层细胞为材料制备原生质体,采用全细胞模式记录基本电流,检测到了跨膜的钙电流,并检测到在根原生质体质膜上存在超极化激活的电压依赖性的钙通道。通过对热处理前后质膜跨膜电流的记录,我们发现在热激后质膜跨膜电流在-200mV下的电流强度较热激处理前增大2倍以上,这证明了热激后质膜上钙通道活性是明显提高的,暗示根原生质体质膜钙通道参与了热激引起的胞内钙升高的过程。为了进一步研究质膜钙通道参与了热激引起的胞内钙升高过程中的关键基因,我们从拟南芥突变体库中得到了感兴趣的基因的T-DNA插入缺失突变体,并对其进行耐热性的分析,结果发现:有一基因（AtCNGCx）的T-DNA插入缺失突变体表现为比较明显耐热性下降现象,该基因为环核苷酸门控通道（CNGC）家族之中的一个成员。膜片钳的结果显示,在热激条件下,cngcx-1突变体（AtCNGCx转录本完全缺失）没有表现出和野生型类似的电流明显变大的现象,而cngcx-2突变体（存在部分的AtCNGCx转录本）与野生型的表现相似。这表明在AtCNGCx完全缺失之后,细胞受到热激后细胞质膜跨膜电流升高的现象消失,暗示AtCNGCx可能是负责热激后产生钙信号的重要基因。通过以上两方面的实验的结果表明:无论是PLCs介导的胞内钙库的释放,还是质膜CNGCs介导的胞外钙库的释放,均可能参与了热激引起的钙原初反应的过程。
论文目录
摘要Abstract缩写表第一部分 文献综述第一章 热激与热激信号转导1 热激反应与热激蛋白1.1 热激反应1.2 热激蛋白1.2.1 热激蛋白的种类1.2.2 热激蛋白的生理功能1.2.2.1 分子伴侣功能1.2.2.2 信号转导中的作用1.2.2.3 发育中起作用2 热激蛋白基因表达的调控2.1 热激元件（HSE）2.2 热激转录因子（HSF）2.3 热激基因表达的转录调节2.3.1 HSF 的三聚化和核转位2.3.2 HSF 的磷酸化调节2.3.3 热激蛋白对HSF 的反馈调节3 热激信号转导3.1 氧化胁迫与热激信号转导3.2 cAMP 与热激信号转导3.3 钙－MAPK 途径3.4 植物激素与热激信号转导3.5 IP与热激信号转导3.6 钙－钙调素信号系统与热激反应2+、CaM 在细胞信号转导中发挥作用'>3.6.1 Ca2+、CaM 在细胞信号转导中发挥作用2+、CaM 在热激反应中发挥作用'>3.6.2 Ca2+、CaM 在热激反应中发挥作用3.6.3 热激信号转导的钙-钙调素途径第二章 植物中的钙信号及 CNGC 离子通道1 植物中的钙信号1.1 钙信号的产生1.1.1 质膜去极化激活的钙通道（DACCs）1.1.2 质膜超极化激活的钙通道（HACCs）1.1.3 质膜上的非选择离子通道（NSCCs）1.1.4 植物细胞内膜系统中的钙通道1.1.5 植物中的钙泵及钙转运体1.2 钙信号编码的特异性1.2.1 生理学地址（physiological address）1.2.2 特征性钙信号的产生(Calcium at the Crossroads of Signali1.2.2.1 植物钙信号的收敛性与特异性1.2.2.2 钙签名（Casignature）1.2.2.2.1 钙瞬变（calcium transient）1.2.2.2.2 钙振荡（calcium oscillation）1.2.2.2.3 钙波（calcium wave）1.2.2.2.4 钙信号的空间定位1.3 钙信号的解码（Decoding）2 CNGC 离子通道2.1 CNGC 基因家族的发现与概况2.2 植物 CNGC 的结构2.3 植物 CNGC 的功能2.3.1 离子的转运2.3.2 植物抗病原体过程2.3.3 逆境胁迫过程2.3.4 生长发育过程2.4 植物 CNGC 的作用机制第三章 植物磷脂酶 C 研究进展1 植物中的磷脂酶 C2 植物磷脂酶C 基因克隆与结构特征3 PLC 的活性调节3和IP3受体及DAG'>4 IP3和IP3受体及DAG5 植物磷脂酶C 功能5.1 参与 ABA 信号5.2 参与渗透胁迫应答5.3 花粉管的生长调节5.4 其他信号系统第二部分 研究论文前言3与热激反应'>第一章 PLC-IP3与热激反应一 实验材料及设备1 实验材料2 实验试剂和仪器3 质粒和菌种4 培养基二 实验方法1 拟南芥的种植3的提取'>2 IP3的提取3含量标线液的配置'>3 IP3含量标线液的配置3含量的测定'>4 IP3含量的测定5 拟南芥愈伤组织诱导及悬浮细胞培养6 悬浮细胞活性的检测7 水母发光蛋白辅基孵育及发光检测8 GUS 定量测定9 RNA 的提取10 RNA 浓度及纯度的鉴定11 实时定量 PCR 检测12 RT-PCR 克隆特定基因13 PCR 扩增目的片段14 DNA 琼脂糖电泳15 DNA 片段的回收16 目的片段的亚克隆及鉴定17 质粒 DNA 的小量提取（碱裂解法）18 DNA 酶切19 DNA 片段的连接2法细菌感受态细胞的制备'>20 CaCl2法细菌感受态细胞的制备21 细菌转化22 基因枪法转化洋葱表皮三 实验结果及分析1 标准曲线2 热激引起的IP变化3介导的热激引起的Ca2+变化'>3 IP3介导的热激引起的Ca2+变化4 GUS 标准曲线5 不同的诱导时间和温度对转基因拟南芥GUS 酶活的影响3对转基因拟南芥GUS 活力的影响'>6 IP3对转基因拟南芥GUS 活力的影响7 U73122 对转基因拟南芥 GUS 活力的影响8 PLCs 在拟南芥中的表达9 PLCs 热激后的表达变化10 C2 结构域参与热激响应10.1 PLCb 的C2 结构域10.2 PAVA321-YFP-C2（PLCb）载体的构建10.3 PLCb 的C2 结构域热激后前后的定位四讨论第二章 离子通道与热激反应一 实验材料及设备1 实验材料2 实验试剂和仪器3 质粒和菌种4 培养基二 实验方法1 拟南芥的种植2 膜片钳分析2.1 拟南芥根表皮原生质体的制备2.2 拟南芥根表皮原生质体FDA 活性染色2.3 膜片钳分析的模式2.4 膜片钳分析中玻璃电极的拉制2.5 膜片钳全细胞模式下电流的记录2.6 膜片钳后期的数据处理3 RNA 的提取4 RNA 浓度及纯度的鉴定5 RT-PCR 克隆特定基因6 PCR 扩增目的片段7 DNA 琼脂糖电泳8 DNA 片段的回收9 目的片段的亚克隆及鉴定10 质粒 DNA 的小量提取（碱裂解法）11 DNA 酶切12 DNA 片段的连接13 CaC12法细菌感受态细胞的制备14 细菌转化15 基因枪法转化洋葱表皮16 PCR 鉴定突变体用的 DNA 小量提取17 RT-PCR 检测基因转录本的有无18 制备农杆菌感受态细胞19 农杆菌的转化及鉴定19.1 农杆菌转化19.2 农杆菌鉴定20 拟南芥的转化及筛选21 拟南芥的热激处理三 实验结果及分析1 原生质体的制备及活性检测2 根细胞质膜钙电流的记录2+通透性通道的鉴定'>3 根细胞质膜 Ca2+通透性通道的鉴定3.1 尾电流分析+通道阻断剂分析'>3.2 K+通道阻断剂分析2+通道阻断剂分析'>3.3 Ca2+通道阻断剂分析3.4 二价阳离子选择性分析2+通透性通道记录'>4 热激处理下细胞质膜Ca2+通透性通道记录5 CNGC 基因家族突变体的鉴定5.1 DNA 水平鉴定5.2 RNA 水平鉴定6 AtCNGCs 突变体耐热性分析7 CNGCx 亚细胞定位7.1 PAVA-CNGCx-YFP 载体的构建7.2 基因枪法检测AtCNGCx 的亚细胞定位2+通透性通道活性分析'>8 AtCNGCx 突变体在热激前后细胞质膜 Ca2+通透性通道活性分析9 细胞质膜上的cAMP 激活型电流的检测10 cngcx-1 转基因恢复植株和过表达 CNGCx 转基因植株的获得10.1 pCAMBIA1300-35S5::CNGCx, pCAMBIA1300-35S::CNGCx-GUS 的构建10.2 拟南芥的遗传转化、筛选及转基因植株DNA 水平的鉴定10.3 CNGCx 转基因株系的表型分析四 讨论1 膜片钳技术用于研究质膜钙通道2 拟南芥根细胞跨膜钙电流3 拟南芥根细胞跨膜钙通道在热激处理下的活性变化4 AtCNGCx 离子通道与热激信号转导4.1 热激信号转导原初反应中相关钙通道基因的筛选4.2 AtCNGCx 突变体耐热性的变化及定位4.3 AtCNGCx 突变体的膜片钳分析4.4 AtCNGCx 在热激信号中的地位及后期的工作第三章 CBK3 与热激反应（附）一 实验材料及设备1 实验材料2 实验试剂和仪器3 培养基二 实验方法1 转基因植株 GUS 染色2 拟南芥材料的热激处理a. 定量 PCR 中拟南芥材料的热激处理b. 蛋白电泳及免疫印记中拟南芥材料的热激处理3 RNA 的提取4 RNA 浓度及纯度的鉴定5 实时定量 PCR 检测6 植物全蛋白的提取7 植物全蛋白的浓度测定8 植物全蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）9 免疫印迹法（Westernblot）三 实验结果及分析1 AtCBK3 在各组织表达及定位2 在热激条件下野生型、突变体及不同转基因株系的基因表达分析3 热激条件下野生型、cbk3 突变体及转基因株系中的蛋白积累参考文献个人简历致谢
相关论文文献
标签：拟南芥论文; 离子通道论文; 热激蛋白论文; 热激信号转导论文;
