肌酸激酶的折叠及聚沉机理研究

论文摘要

本文以肌酸激酶为折叠及聚沉模式蛋白质,研究了兔脑肌酸激酶（RBCK）、人脑肌酸激酶（HBCK）和兔肌肌酸激酶（RMCK）的折叠及聚沉机理。研究了锌离子对RBCK和HBCK活力的影响,结果表明,低浓度的锌离子基本抑制了RBCK和HBCK的活力;高浓度的锌离子会引起RBCK和HBCK的聚沉,并且发现它们的聚沉是温度、酶浓度及锌离子浓度依赖性的。而且研究了甘油、蔗糖、甘氨酸和脯氨酸对锌离子引起的RBCK和HBCK聚沉的影响。结果表明甘氨酸和脯氨酸能防止聚沉,并且能部分恢复酶的构象和活力。研究了RMCK的半胱氨酸残基修饰后的聚沉动力学过程。研究结果表明:在锌离子作用下,RMCK聚沉受不同pH值的调节。发现使用DTNB对酶活性部位的半胱氨酸残基的修饰会导致明显的剂量依赖的聚沉。该聚沉过程伴随转化自由能（ΔΔGAG）和疏水表面的变化,DTT、甘氨酸与脯氨酸能提高ΔΔGAG,减少RMCK聚沉,并能恢复RMCK活力。初步建立了阻止RMCK聚沉的方法。研究了部分折叠的单体肌酸激酶（PF-CK）的折叠与聚沉。研究结果表明:由于PF-CK单体疏水表面相互作用,PF-CK发生聚沉。单体PF-CK能够在含环糊精和二巯基苏糖醇（DTT）溶液里正确再折叠。人工分子伴侣SDS-环糊精可防止聚沉,并再折叠PF-CK。这些聚沉及折叠途径遵循一级动力学过程。以牛视网膜肌酸激酶链A（PDB entry:1G0W）为结构模板,预测了RBCK与HBCK高清晰度的三维结构,模拟了锌离子与脑型肌酸激酶之间、RBCK与丙烯酰胺之间、HBCK与SDS之间的对接实验。结构预测的研究结果为:锌离子、SDS及丙烯酰胺分别与酶的活性部位结合。SDS与HBCK上的ARG132、ARG320和ARG341结合,而RBCK的残基CYS74和GLY73可能与丙烯酰胺结合。通过上述研究,进一步完善了肌酸激酶序列折叠途径,并且从空间结构上探索酶的结合方式,对肌酸激酶的聚沉机理及神经衰退性疾病的关系进行了探讨。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 蛋白质聚沉研究的概述
• 1.1.1 蛋白质聚沉的分类及定义
• 1.1.2 生物工程中的蛋白质聚沉
• 1.1.3 二级结构和疏水作用影响蛋白质聚沉
• 1.1.4 折叠中间体与蛋白质聚沉
• 1.1.5 蛋白质聚沉与疾病
• 1.1.6 蛋白质聚沉与淀粉样斑的形成
• 1.1.7 聚合及聚沉在多聚谷氨酰胺疾病病因中的作用
• 1.1.8 蛋白质聚沉与金属离子
• 1.1.9 蛋白质聚沉抑制研究
• 1.1.10 动力蛋白与自噬作用在清除易聚沉蛋白质中起重要作用
• 1.2 蛋白质折叠研究的概述
• 1.2.1 蛋白质折叠研究的概况
• 1.2.2 蛋白质的折叠机理和模型探讨
• 1.2.3 蛋白质折叠的研究方法和技术手段
• 1.2.4 蛋白质折叠的能量学
• 1.2.5 蛋白质错误折叠与疾病
• 1.2.6 蛋白质折叠与蛋白质进化
• 1.3 分子伴侣与疾病
• 1.3.1 分子伴侣
• 1.3.2 分子伴侣和蛋白质生物合成
• 1.3.3 大脑缺氧及肌肉萎缩疾病中蛋白质聚沉与分子伴侣的作用
• 1.4 肌酸激酶与锌离子
• 1.5 本论文的研究工作
• 第2章 锌离子对兔脑型肌酸激酶的活力构象及聚沉的影响
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 兔脑型肌酸激酶的纯化
• 2.3.2 锌离子对RBCK 活力的影响
• 2.3.3 RBCK 与锌离子作用后的内源荧光光谱
• 2.3.4 RBCK 与锌离子作用后的ANS 结合荧光
• 2.3.5 RBCK 与锌离子作用后的圆二色光谱
• 2.3.6 RBCK 与锌离子作用后，Gly 及Pro 对其的活力的影响
• 2.3.7 RBCK 与锌离子作用后，Gly 及Pro 对其ANS 结合荧光的影响
• 2.3.8 温度、锌离子及RBCK 浓度对聚沉的影响
• 2.3.9 Gly 及Pro 能防止锌离子引起的RBCK 聚沉
• 2.4 讨论
• 2.4.1 RBCK 的纯化
• 2.4.2 锌离子对RBCK 活力及结构的影响
• 2.4.3 锌离子对RBCK 聚沉的影响
• 2.4.4 Gly 及Pro 能防止锌离子引起的RBCK 聚沉
• 第3章 半胱氨酸残基修饰及锌离子作用下的肌酸激酶聚沉
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 pH 对锌离子诱导CK 聚沉的影响
• 3.3.2 在锌离子存在下，DTNB 修饰对CK 聚沉的影响
• 3.3.3 锌离子对DTNB-修饰CK 的作用
• 3.3.4 DTT-介导抑制CK 聚沉
• 3.3.5 使用Gly 和Pro 阻止CK 聚沉
• 3.3.6 在锌离子存在下，Gly 和Pro 对CK 的复活作用
• 3.4 讨论
• 第4章 单体肌酸激酶聚沉与SDS-环糊精协助再折叠
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.3 结果
• 4.3.1 通过特定条件修饰CK 后得到单体CK
• 4.3.2 PF-CK 聚沉和SDS 的作用
• 4.3.3 聚沉后上清液PF-CK 的复活
• 4.3.4 应用SDS-环糊精作为人工伴侣来复活PF-CK
• 4.3.5 PF-CK 在不同条件下的再折叠
• 4.4 讨论
• 第5章 锌离子对重组人脑肌酸激酶的活力构象及聚沉的影响
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.3 结果
• 5.3.1 锌离子对HBCK 的活力影响
• 5.3.2 HBCK 与锌离子作用后的内源荧光光谱
• 5.3.3 HBCK 与锌离子作用后的ANS 结合荧光
• 5.3.4 HBCK 与锌离子作用后的圆二色光谱
• 5.3.5 HBCK 与锌离子作用后，Gly 及Pro 对其的活力的影响
• 5.3.6 HBCK 与锌离子作用后，Gly 及Pro 对其ANS 结合荧光的影响
• 5.3.7 温度、锌离子及HBCK 浓度对聚沉的影响
• 5.3.8 Gly 及Pro 能防止锌离子引起的HBCK 聚沉
• 5.4 讨论
• 5.4.1 锌离子对HBCK 活力及结构的影响
• 5.4.2 锌离子对HBCK 聚沉的影响
• 5.4.3 Gly 及Pro 能防止锌离子引起的HBCK 聚沉
• 第6章 用计算机模拟脑型肌酸激酶的结合构象图
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.3 结果
• 6.3.1 同源模拟中脑型肌酸激酶的结构模板
• 6.3.2 计算机模型预测RBCK 的3D 结构和锌离子的对接模拟实验
• 6.3.3 计算机模型预测HBCK 的三维结构和SDS 的对接模拟实验
• 6.3.4 In Silico Docking 分析兔脑肌酸激酶与丙烯酰胺的结合
• 6.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果