减蛋综合征病毒五邻体、纤维蛋白和六邻体的原核表达及抗原性分析

论文摘要

减蛋综合征（Egg Drop Syndrome,EDS-76）是由减蛋综合征病毒（EDSV）引起的一种以产蛋鸡产薄壳或无壳蛋,产蛋率严重下降为主要特征的传染病,该病在世界范围内的发生和流行给养鸡业带来了巨大的经济损失。本研究以EDSV京911株为基础材料,经过鸭胚繁毒、提取DNA,并以此为模板,参考GenBank上发表的国际标准株AV-127的全基因序列（序列号AC000004）设计了8对特异性引物,PCR扩增出目的基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,转化到宿主菌TG1感受态细胞中,经质粒PCR、酶切鉴定以及测序证明,最终得到了该株病毒包含52/55k、Ⅲa、五邻体、pⅦ、pⅩ、pⅥ、六邻体、EP、100k、pⅧ和纤维蛋白的部分基因,共15715bp。将EDSV京911株与其它腺病毒进行核苷酸和氨基酸序列比对,结果显示EDSV京911株与AV-127株高度同源,除纤维蛋白和pⅧ外,其它蛋白的同源性都在99.00%以上,其中五邻体、六邻体、巯基内肽酶、PⅥ和PⅩ氨基酸序列完全一致,由此推论EDSV京911株与AV-127株可能为同一基因型。同时,根据序列比对结果绘制了五邻体、六邻体和巯基内肽酶系统发生树,结果显示EDSV与OAV287和BAdV-4遗传关系最近。根据已获得的京911株核苷酸序列,并参考AV-127株的五邻体、纤维蛋白和六邻体全基因序列,分别设计合成了带有酶切位点的特异性引物,最终克隆得到包括起始密码子和终止密码子在内的完整基因序列。将目的基因通过EcoRI和HindⅢ位点插入到表达载体pET-30a（+）,获得的阳性质粒分别命名为pET-30a-Penton、pET-30a-Fiber和pET-30a-Hexon,将阳性质粒转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,结果显示分别得到了大小约54.0ku、69.7ku和110.0ku的重组蛋白,经Western-blotting、琼脂双扩散和Dot-ELISA检测,重组五邻体蛋白具有较好的抗原性。本研究成功克隆了EDSV京911株部分基因,为构建EDSV载体打下了良好的基础;同时利用原核表达系统成功表达了EDSV的三个主要结构蛋白,重组五邻体蛋白具有较好的抗原性,为进一步研究EDSV结构蛋白和建立新的EDSV检测方法奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 引言
• 1.1 历史及分布
• 1.2 流行病学
• 1.3 病原的基本生物学特性
• 1.4 病原的分类地位
• 1.5 病原的基因组特点
• 1.5.1 末端倒置重复序列（ITR）
• 1.5.2 E1 区
• 1.5.3 E2 区
• 1.5.4 E3 区和E4 区
• 1.5.5 L 区
• 1.6 EDSV 载体的研究进展
• 1.6.1 人腺病毒载体的研究发展
• 1.6.2 EDSV 载体的研究进展
• 1.7 EDSV 分子生物学诊断方法的研究进展
• 1.8 研究的目的和意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 毒株、宿主菌、质粒载体和血清
• 2.1.2 实验动物
• 2.1.3 工具酶与试剂盒
• 2.1.4 仪器和设备
• 2.1.5 主要试剂配置
• 2.2 方法
• 2.2.1 病毒的增殖
• 2.2.2 兔抗EDSV 多克隆血清的制备
• 2.2.3 核酸的提取
• 2.2.4 EDSV 部分基因的克隆
• 2.2.5 五邻体、纤维蛋白和六邻体的原核表达
• 2.2.6 重组蛋白的抗原性分析
• 3 结果
• 3.1 基因克隆
• 3.1.1 基因片段PCR 扩增结果
• 3.1.2 阳性重组克隆质粒的鉴定
• 3.1.3 基因测序及序列分析
• 3.2 五邻体、六邻体和纤维蛋白的原核表达
• 3.2.1 目的基因的扩增
• 3.2.2 目的片段的克隆及鉴定
• 3.2.3 阳性重组表达质粒的鉴定
• 3.2.4 蛋白表达检测和纯化
• 3.3 重组蛋白的抗原性分析
• 3.3.1 Western-blotting 检测
• 3.3.2 琼脂双扩散
• 3.3.3 Dot-ELISA
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文