重组杆状病毒高效筛选方法的建立

论文摘要

杆状病毒表达载体系统（BEVS）目前已发展成为一种高效率的真核细胞表达载体系统,其在研究基因表达调控、蛋白质结构和功能分析、生物活性物质的制备及基因治疗等方面发挥着越来越重要的作用。但是在构建BEV的过程中,重组病毒的空斑筛选操作技术性强,效率低,成为了制约BEVS发展的瓶颈步骤。本论文针对这一问题,提出了一种筛选重组病毒的新方法:利用杆状病毒gp64表面展示系统,在重组病毒表面展示标签蛋白,通过亲和层析的方法,筛选出重组病毒。本实验采用基因工程技术构建了转移载体gst-gp64-rfp-pFastBacl,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统,构建重组杆粒gst-gp64-rfp-Bacmid。同时构建了两个对照重组杆粒:gp64-rfp-Bacmid,gst-rfp-Bacmid。重组杆粒转染sf9细胞48h后,在荧光显微镜下（最大发射波长583nm,最大吸收波长为558nm）可观察到红色荧光。说明外源基因rfp在sf9细胞内表达。利用RT-PCR对外源基因gst-gp64、gp64及gst在sf9细胞中的转录情况进行检测,扩增出目的片段。证明rfp、gp64、gst及gst-gp64融合基因在sf9细胞内进行转录。三种重组病毒液分别通过Glutathione Sepharose 4B medium,收集流出液和洗脱液并分别感染sf9细胞。两个对照重组病毒液经过亲和层析后的流出液重感染sf9细胞,在荧光显微镜下可以观察到细胞内有红色荧光,而洗脱液重感染的sf9细胞没有观察到荧光。说明只表达了GST蛋白或gp64蛋白的重组病毒没有吸附到GST亲和介质上,无法通过GST亲和层析筛选。gst-gp64-rfp-Bacmid的病毒液通过GST亲和层析介质后,流出液重感染的sf9细胞没有观察到荧光,而洗脱液重感染后观察到sf9细胞有红色荧光。说明表达了GST-gp64融合蛋白的重组病毒,由于在病毒表面展示了GST标签蛋白,可以被吸附到亲和层析介质上并通过洗脱收集。因此,在构建BEV时,将gst-gp64融合基因与感兴趣的目的基因同时克隆到杆状病毒转移载体中,同源重组后,即可利用GST亲和层析凝胶介质直接从重组病毒和野生病毒的混合液中通过亲和层析筛选出携带有目的基因的重组病毒。这将大大提高构建BEV的效率,促进杆状病毒表达载体的进一步发展与应用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 昆虫杆状病毒
• 1.2 杆状病毒表达载体系统（BEVS）
• 1.2.1 杆状病毒表达载体的特点和研究进展
• 1.2.2 杆状病毒表达载体系统的构建
• 1.2.3 Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统
• 1.3 其他杆状病毒表达载体研究进展
• 1.4 杆状病毒表面展示系统
• 1.4.1 杆状病毒表面展示系统的基础是gp64蛋白
• 1.4.2 杆状病毒表面展示系统的研究进展
• 1.5 本论文设计的构思
• 1.5.1 本论文的立题依据
• 1.5.2 本实验的技术路线
• 2 柞蚕杆状病毒gp64基因的克隆及 gst-gp64融合基因的构建
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 ApNPV基因组DNA的提取
• 2.2.2 E.coli DH5α感受态细胞的制备
• 2.2.3 DNA转化E.coli DH5 α感受态细胞
• 2.2.4 PCR 引物设计与合成
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 ApNPV基因组DNA的提取
• 2.3.2 gp64基因的扩增
• 2.3.3 gst基因的扩增
• 2.3.4 gst-gp64融合基因的构建
• 2.4 小结
• 3 重组杆粒gst-gp64-rfp-Bacmid的构建
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 质粒的小量提取
• 3.2.2 DNA片段5′末端去磷酸化
• 3.2.3 E.coli DH10Bac感受态细胞的制备
• 3.2.4 质粒转化
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 转移载体gst-gp64-rfp-pFastBacl的构建策略
• 3.3.2 质粒gst-gp64-pFastBacl的构建
• 3.3.3 转移载体gst-gp64-rfp-pFastBacl的构建
• 3.3.4 重组杆粒gst-gp64-rfp-Bacmid的构建
• 3.4 小结
• 4 对照杆粒gp64-rfp-Bacmid和gst-rfp-Bacmid的构建
• 4.1 实验材料
• 4.2 PCR引物的设计与合成
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 gst、gp64基因的克隆
• 4.3.2 转移载体gst-rfp-pFastBacl、gp64-rfp-pFastBacl的构建策略
• 4.3.3 gst-pFastBacl及gp64-pFastBacl载体的构建
• 4.3.4 转移载体gst-rfp-pFastBacl和gp64-rfp-pFastBacl的构建
• 4.3.5 对照杆粒gst-rfp-Bacmid及gp64-rfp-Bacmid构建
• 4.4 小结
• 5 重组杆状病毒的GST亲和层析筛选
• 5.1 实验材料
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 sf9细胞的培养
• 5.2.2 细胞转染实验
• 5.2.3 细胞总RNA的提取
• 5.2.4 RT-PCR
• 5.2.5 Glutathione Sepharose 4B medium亲和纯化重组病毒
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 重组病毒gst-gp64-rfp-Bacmid、gst-gp64-Bacmid、gp64-rfp-Bacmid的扩增
• 5.3.2 红色荧光蛋白基因的表达
• 5.3.3 gst-gp64、gst及gp64基因在sf9细胞中的表达
• 5.3.4 重组病毒的筛选
• 5.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢