Philotrypesis属榕小蜂CYP6基因克隆和进化分析

论文摘要

细胞色素P450（Cytochrome P450）酶系在细菌、真菌、植物和动物中都有广泛分布,它能够代谢外源物质和内源物质,在生物体内发挥重要的作用。编码细胞色素P450氧化酶的基因构成一个古老的基因超家族,它们起源于一个共同的祖先。其中,CYP6是细胞色素P450基因超家族的一个家族,它们是昆虫中特有的,其蛋白产物在对异源物质包括植物次生物质、植物毒素、杀虫剂、环境有毒物质等代谢中起着很重要的作用。不同的细胞色素P450基因都存在一些保守区,可能在所有P450基因发挥共同的重要作用,同时,P450基因又表现出明显的多样性,主要体现在其可变区。在保守区净化选择可能占优势;而可变区的变异主要来源于适应性进化和中性随机漂变,这些变异致使催化底物的宽度和专一性改变使生物体适应多变的环境。Thomas借助PAML3.14软件在分子水平上证明了一些系统发生不稳定的基因家族成员符合适应性进化,有些功能关键氨基酸接受正向选择。基因复制是产生具有新功能的基因和基因家族多样性主要原因之一。通过基因复制事件产生的基因家族成员往往遭遇正向选择驱使的快速适应性进化,在这方面对基因家族进化的研究是一种新趋势。非同义-同义置换速率比值（dN/dS）是密码子水平评价选择压力的一项灵敏指标,dN/dS比值（ω）= 1, < 1和>1分别表示中性进化、净化选择和正选择作用（即适应性进化）。基于最大似然法的“位点特异性”模型在检测给定基因正选择时有较高的检验效力。在榕树-榕小蜂共生体系中,榕树为榕小蜂提供食物和栖息环境,同时榕树依靠榕小蜂传粉实现其种群的繁衍,此共生体系是研究植物与昆虫精细适应、毒力进化等进化学问题的理想材料。在直径只有几个厘米大小的榕果（榕树的果状隐头花序）里生活着一种专一地为榕树传粉的传粉榕小蜂,还有几种乃至几十种非传粉榕小蜂。榕小蜂由于长期生活在榕果里,它们的外部形态特征、内部生理等都发生了很多适应性的变化。细胞色素P450酶系在昆虫与其寄主植物相互关系中发挥重要的作用,其中CYP6家族基因的代谢解毒作用是大多数昆虫适应其寄主植物的主要机制。迄今为止,关于榕小蜂的CYP6家族基因尚未见报道。因此,我们旨在获得非传粉榕小蜂Philotrypesis属若干物种的CYP6家族基因成员并了解它们的特点。在此基础上,集中讨论下面两个问题:（1）生活在这种特殊环境里的Philotrypesis,其CYP6亚基因家族成员扩张是否是通过基因复制。（2）由于生活环境的特殊性,我们获得的CYP6基因片段编码的氨基酸不同位点选择压力存在怎样的差异,以及它们的进化式样是怎样的。通过本文的研究,用PCR的方法获得了Philotrypesis属榕小蜂9条CYP6基因片段: CYP6CK1、CYP6AQ2、CYP6AQ3、CYP6AS20、CYP6AS21、CYP6AS22、CYP6AS23、CYP6AS24、CYP6AS25,这些基因序列都包含编码蛋白疏水螺旋区I和血红素结合域的区域。借助MEGA 4.0和PAML 4.0对数据构建基因树和选择压力检测,我们发现榕小蜂的CYP6AS、CYP6AQ、CYP6CK基因亚家族扩张是通过基因复制方式。在基因树CYP6AS分支上,在CYP6AS20（Philotrypesis pilosa ） / CYP6AS21 （ Philotrypesis sp. ） / CYP6AS22 （ Philotrypesis sp.1）/ CYP6AS23（Philotrypesis sp.4）形成一支,bootstrap值为100,可能在这些物种形成之前发生过基因复制事件。基于最大似然法的“位点特异性”模型（Site-specific Model）检测发现CYP6AS亚家族的基因符合净化选择,一些氨基酸表现很高的保守性,可能在榕小蜂适应榕树生存中起到关键作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章前言
• 1 细胞色素P450 的基本特征及命名
• 1.1 细胞色素P450 的基本特征
• 1.2 细胞色素P450 的命名
• 2 昆虫CYP6 基因家族的多样性
• 2.1 昆虫CYP6 基因家族种类多样性
• 2.2 昆虫P450 分布多样性
• 2.3 昆虫CYP6 基因家族功能多样性
• 2.3.1 CYP6 参与昆虫对杀虫抗性代谢
• 2.3.2 CYP6 家族基因在昆虫与植物相互关系中的作用
• 3 P450 基因超家族的进化
• 3.1 P450 基因内含子外显子结构
• 3.2 P450 基因家族的进化
• 4 P450 假基因及其进化
• 5 榕树和榕小蜂协同进化体系
• 5.1 榕树与榕小蜂
• 5.1.1 榕树
• 5.1.2 榕小蜂
• 5.2 对叶榕及其非传粉榕小蜂
• 5.3 垂叶榕及其非传粉榕小蜂
• 第二章 榕小蜂CYP6 基因的克隆和系统发育分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料、标本鉴定和储存
• 1.2 主要仪器设备和试剂
• 1.3 榕小蜂P450 基因的克隆
• 1.3.1 榕小蜂基因组DNA 提取
• 1.3.2 PCR 引物设计与合成
• 1.3.3 PCR 扩增和测序
• 1.4 基因数据的获得
• 1.5 系统发生树建立
• 2 结果与分析
• 2.1 克隆获得榕小蜂P450 基因序列
• 2.2 序列分析
• 2.3 基因树分析
• 3 讨论
• 第三章 CYP6AS 亚家族基因进化分析
• 1 材料和方法
• 1.1 PAML4.0 常用功能和模型介绍数据处理
• 1.2 数据处理
• 1.2.1 序列获得
• 1.2.2 Phyilip 软件的构建NJ 树
• 1.2.3 CYP6AS 亚家族基因蛋白编码序列选择压力的检测
• 1.2.4 MEGA 4.0 对结果进行Z 检验
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 附录1. 第二章构建基因树用到的数据
• 附录2. 第三章中自然选择压力检测用到的数据
• 致谢
• 攻读硕士期间论文发表情况