加味黄芩汤对感染鼠耐药大肠杆菌acrAmRNA表达及鼠生化指标的影响

论文摘要

收集患者尿液,一共分离15株大肠杆菌的疑似菌株,通过病原培养和生化鉴定,鉴定出2751：O148+O1和2952：O142+O26+O13共2个分离株的血清型。使用20种抗菌药对此2株大肠杆菌菌株的耐药性进行检测,得出此2种菌株均属于多重耐药菌株。提取加味黄芩汤（MSS）和加减三黄汤（MTYS）,采用试管倍比稀释法、平板打孔法等分别测定各菌株的耐药性,对多重耐药E.coli和标准株ATCC25922测定MIC,选择抑菌作用较好的中药处方为MSS。然后确定该中药处方和E.coli各自在小鼠体内的使用剂量和攻毒剂量。选取健康小白鼠100只,常规饲养7d后随机分为5组,分别编号为：健康组（A组）、攻毒组Ⅰ（B组）、攻毒组Ⅱ（C组）、治疗组Ⅰ（D组）、治疗组Ⅱ（E组）,每组20只,除A组外,其余各组按每只小鼠腹腔注射试验菌液0.2mL（约含菌1.6×108CFU）进行攻毒,A组腹腔注射生理盐水0.2mL。自造模第1天起,A、B、C组每日上午10：00灌服生理盐水0.5mL,D组和E组分别灌服浓缩为1g/mL的MSS浸提制剂0.5mL,连续7d,第8d清晨剖解提取血样,检测生化指标。同时取肝组织接种到琼脂平板,挑取单个菌落接种E.c肉汤中,培养16-24h后,测定药敏范围,分离耐药大肠杆菌。MSS对人工感染耐药E.coli后小鼠生化指标有明显的影响：（1）MSS能够促进机体免疫器官脾、肝的发育,从而提高机体免疫力；（2）能够明显使血清中ALT、AST、GLU的含量降低,具有保肝利胆作用；MSS能显著提高血清中AMY、ALP,以及Ca含量,有维持血液中钙平衡的作用；（3）能够减轻各种因素对肾脏的损害,增进采食量和调节微循环。对分离的大肠杆菌测定MIC,同时对这些多重耐药E.coli提取质粒,根据GenBank公布的大肠杆菌全基因序列（NC000913）,设计特异性引物,对大肠杆菌外输泵基因acrA进行PCR扩增、测序。设计acrA基因荧光探针及小片段,将扩增产物克隆到pGM-T载体,转化大肠杆菌DH5α,经X-Gal和IPTG诱导进行蓝白斑筛选,提取质粒,作为荧光定量标准。提取总RNA,反转录为cDNA,实时荧光定量测定acrA的mRNA表达量。结果：（1）acrA基因测序无突变,表明并非由于基因突变所致耐药；（2）实时荧光定量测定acrA的mRNA表达量：2751号拷贝数最高达1016,比2952号要高。不同程度耐药株表达量不同,以十进位相差,高者相差近1000倍。各菌株均比ATCC25922表达量高,差异极显著（P≤0.01）。耐药性越大的拷贝数越多,经MSS治疗后,acrA表达量普遍减小,逆转效果增大,表明表达量与耐药性成正相关。结论：MSS可以降低耐药大肠杆菌acrA的mRNA表达量,且与耐药性有很高的相关性。实验结果证明,MSS对多重耐药性大肠杆菌可以起到一定程度的耐药逆转作用,并对动物机体具有一定的免疫保护作用,值得在临床上推广使用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 研究背景及研究意义
• 1.1.1 研究背景
• 1.1.2 研究意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 国内外对耐药性大肠杆菌的研究现状
• 1.2.2 目前存在的问题
• 1.3 研究内容与研究思路
• 1.3.1 中药汤剂的制备
• 1.3.2 大肠杆菌的分离、血清型鉴定及耐药性测定
• 1.3.3 MSS和MTYS对多重耐药大肠杆菌的体外抑制试验
• 1.3.4 动物回归试验
• 1.3.5 MSS对感染鼠耐药E.coli的acrA mRNA表达水平影响
• 1.4 采取的技术路线
• 第二章 耐药性大肠杆菌的分离、血清型鉴定及耐药性测定
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 设备仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 病原菌的分离培养与生化鉴定
• 2.2.2 纯培养
• 2.2.3 大肠杆菌血清型的鉴定
• 2.2.4 药敏试验
• 2.3 结果
• 2.3.1 菌株鉴定情况
• 2.3.2 大肠杆菌药敏试验结果
• 2.3.3 各种药物的最低抑菌浓度
• 2.4 讨论
• 2.4.1 大肠杆菌存在多重耐药性
• 2.4.2 解决多重耐药性的途径
• 2.5 小结
• 第三章 复方中药对多重耐药大肠杆菌的体外抑制试验
• 3.1 材料
• 3.1.1 试验菌种
• 3.1.2 培养基与设备
• 3.1.3 中草药
• 3.2 方法
• 3.2.1 MSS和MTYS的制备
• 3.2.2 两个处方的初步筛选
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 MSS在鼠体内使用剂量及耐药性E.coli在鼠体内攻毒量的确立
• 4.1 材料
• 4.1.1 试验动物
• 4.1.2 试验菌种
• 4.1.3 药品及饲料
• 4.2 方法
• 4.2.1 制备试验菌液
• 4.2.2 确立MSS在鼠体内的使用剂量
• 4.2.3 确立耐药性E.coli在鼠体内的最佳攻毒量
• 4.3 结果
• 4.3.1 MSS在鼠体内最佳使用剂量
• 4.3.2 耐药性E.coli在鼠体内最佳攻毒量
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 MSS对感染耐药E.coli后小鼠生化指标及耐药性的影响
• 5.1 材料
• 5.1.1 试验动物
• 5.1.2 试验菌种
• 5.1.3 设备仪器
• 5.1.4 药物与试剂
• 5.2 方法
• 5.2.1 分组与造模
• 5.2.2 测定指标及测定方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 鼠免疫器官指数的测定结果
• 5.3.2 MSS对鼠大肠杆菌感染后某些生化指标的影响
• 5.3.3 MIC的测定
• 5.4 小结
• 第六章 MSS对感染鼠耐药E.coli的acrA mRNA表达水平影响
• 6.1 材料
• 6.1.1 菌株
• 6.1.2 标准参照物
• 6.1.3 试剂盒
• 6.1.4 主要仪器
• 6.1.5 试剂与酶
• 6.1.6 试液
• 6.1.7 PCR及RT-PCR引物的设计与合成
• 6.2 方法
• 6.2.1 基因大片段的扩增、克隆、测序
• 6.2.2 ATCC25922探针标准基因片段的克隆
• 6.2.3 总RNA的提取
• 6.2.4 cDNA链的合成
• 6.2.5 荧光定量PCR试验步骤
• 6.3 结果
• 6.3.1 耐药株大肠杆菌染色体DNA的提取结果
• 6.3.2 基因组PCR产物凝胶电泳鉴定
• 6.3.3 acrA PCR产物测序结果见附录
• 6.3.4 大肠杆菌acrA探针基因片段的PCR扩增结果
• 6.3.5 克隆质粒的鉴定
• 6.3.6 总RNA鉴定
• 6.3.7 RT-PCR结果
• 6.3.8 制备标准曲线
• 6.3.9 样品acrA的荧光定量结果
• 6.4 讨论
• 6.5 小结
• 第七章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
• 附录