HAb18G/CD147通过调节钙信号依赖的ERK1/2活化调控肝癌细胞周期进程的研究

论文摘要

目的:细胞周期调控与肿瘤的发生发展研究是一个十分重要的领域。研究发现几乎所有肿瘤细胞均存在细胞周期异常,因此,肿瘤也被称为细胞周期病[1]。肿瘤细胞最明显的特征为不依赖于细胞外生长信号的刺激而能反复自发的进行细胞周期循环,增殖细胞增加、凋亡细胞减少,最终诱发细胞不可控制的异常增殖而导致肿瘤形成[2]。通常情况下,细胞的增殖与凋亡处于细胞周期动态平衡的调控之中。细胞周期调控的异常,导致细胞增殖与凋亡的失衡,是诱发肿瘤的关键环节。并且,肿瘤细胞所处的细胞周期时相对于肿瘤的放疗、化疗效果都是至关重要的[3]。因此,进一步探索细胞周期的调控因素,对于肿瘤的预防及治疗均有重要的实际意义。CD147属于一种跨膜糖蛋白,是免疫球蛋白超家族（IgSF）粘附分子,其新成员HAb18G是第四军医大学细胞工程研究中心从肝癌细胞克隆获得的肝癌相关抗原。该分子高表达于人肝癌组织等恶性肿瘤组织[4]。研究表明HAb18G/CD147可诱导肝癌细胞自身及成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶（MMPs）降解基底膜和细胞外基质,促进肝癌细胞的侵袭和增殖。近年来的研究还证实HAb18G/CD147可通过降低细胞内钙离子负性调控的敏感性,升高细胞内钙离子水平,增强人肝癌细胞的侵袭转移能力。并且HAb18G/CD147与整合素（integrin）等关键信号转导分子存在相互作用,提示HAb18G/CD147可能参与细胞内信号转导通路的多个环节介导肿瘤细胞的生物学行为[5-7]。目前研究发现在人黑色素瘤A375细胞、人胰腺癌Panc-1等多种肿瘤细胞[8-9],CD147可促进细胞增殖,然而CD147分子表达变化可否影响肿瘤细胞的周期进程,以及CD147分子调控周期的具体分子机制,目前尚无报道。本研究旨在进一步探索HAb18G/CD147调控肝癌细胞增殖周期的分子机制,阐明HAb18G/CD147的生物学功能,为探讨肿瘤治疗的新靶点、新方法奠定理论基础。方法:利用脂质体转染方法将HAb18G/CD147全长真核质粒、HAb18G/CD147胞外区+跨膜区真核表达质粒、HAb18G/CD147胞内区+跨膜区真核表达质粒、HAb18G/CD147特异性小RNA干扰片断转染至人SMMC-7721肝癌细胞,经Real Time PCR、间接免疫荧光进行表达鉴定。BrdU掺入法检测细胞增殖能力、流式细胞仪检测细胞周期G0/G1期、S期及G2/M期比例变化,Western-blot检测ERK1/2、磷酸化ERK1/2、CyclinD1、激光共聚焦显微镜检测细胞钙内流及细胞内钙库钙离子释放变化。结果:将HAb18G/CD147全长真核质粒转染至人SMMC-7721肝癌细胞成功构建HAb18G/CD147稳定高表达的T7721肝癌细胞,转染HAb18G/CD147特异性小RNA干扰片段构建了瞬时低表达HAb18G/CD147的si-HAb18G肝癌细胞。下调HAb18G/CD147表达,可明显引起细胞周期G0/G1阻滞并抑制肝癌细胞增殖。上调HAb18G/CD147表达可促进ERK1/2的磷酸化及CyclinD1的表达。同时,ERK1/2的抑制剂U0126明显抑制了HAb18G/CD147促进CyclinD1表达的作用。进一步检测发现ERK1/2磷酸化水平及CyclinD1表达随着细胞外钙离子浓度的增加呈剂量依赖性增加。上调HAb18G/CD147表达可促进细胞内钙库释放钙离子。同时,PI3K抑制剂LY294002、Wortmannin显著地抑制了HAb18G/CD147促进细胞内钙库释放钙离子及促进ERK1/2磷酸化、CyclinD1表达的作用。HAb18G/CD147缺失胞外区或胞内区可降低其促进细胞内钙库释放钙离子、促进磷酸化ERK1/2依赖的CyclinD1表达以及促进细胞周期由G0/G1期进入S期的作用。结论: HAb18G/CD147通过激活PI3K,促进细胞内钙库释放钙离子,进一步促进磷酸化ERK1/2依赖的CyclinD1的表达,促进肝癌细胞由G0/G1期进入S期,参与肝癌细胞周期进程,并且HAb18G/CD147胞外区、胞内区对于促进肝癌细胞周期由G0/G1期进入S期均发挥不可或缺的作用。HAb18G/CD147促进细胞周期进程依赖于其全长分子片段的完整性。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 1 肿瘤的发生发展与细胞周期研究进展
• 2 细胞周期调控与钙信号研究进展
• 3 HAb18G/CD147 分子与细胞周期、细胞增殖调控研究进展
• 第一部分 HAb18G/CD147 通过激活 ERK1/2 参与肝癌细胞周期调控的制研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二部分 HAb18G/CD147 通过调节细胞内钙号 调控 ERK1/2 活化的制研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三部分 HAb18G/CD147 胞外区、胞内区参与肝癌细胞周期调控的制研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢