HCV不同长度NS5B的表达纯化及体外活性测定新方法的建立

论文摘要

全球有3%的人感染丙型肝炎病毒（HCV）,可导致肝硬化和肝癌等慢性肝病。目前,无HCV疫苗,主要用α-干扰素和利巴韦林治疗,但有较大的副反应,并且应答率仅约50%。因此,需要研制出更有效更广谱的抑制剂。HCV NS5B是RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）,是HCV复制的关键酶,在正常的宿主细胞中不存在这个酶的相似结构同系物。因此这是一个抗病毒研究的很好的靶标,已用于体外筛选HCV抑制剂。体外筛选HCV NS5B蛋白酶抑制剂的关键是获得溶解性好、活性高的NS5B蛋白,NS5B蛋白C端对其酶活性及水溶性有影响。本研究制备NS5B蛋白C端删除不同长度的三种重组蛋白,以筛选溶解性好、活性高的NS5B蛋白,建立体外检测NS5B蛋白RNA依赖的RNA聚合酶活性的新方法,为高通量筛选HCV抑制剂奠定基础。构建了高效表达全长NS5B（NS5B-FL）、C端截短21个氨基酸NS5B（NS5B-C21）及C端截短51个氨基酸NS5B（NS5B-C51）蛋白的三种工程菌。利用PCR技术扩增三种长度的NS5B基因,BamHⅠ和XhoⅠ双酶酶切后连接到经同样酶酶切的原核表达载体pET-28a（+）上,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳进行鉴定。成功构建了三种重组质粒pET-28a（+）-NS5B-FL,pET-28a（+）-NS5B-C21,pET-28a（+）-NS5B-C51,分别表达6His-NS5B-FL,6His-NS5B-C21,6His-NS5B-C51三种融合蛋白,表达的6His-NS5B-FL主要以包涵体形式存在,而表达的6His-NS5B-C21、6His-NS5B-C51的可溶性明显增加。建立了表达的三种HCV NS5B蛋白的纯化方法,纯化获得了三种蛋白。为易于纯化,在表达三种蛋白的C端均增加了6xHis标签,用Ni柱亲和层析纯化,获得的三种蛋白经SDS-PAGE检测,均显示单一的蛋白条带。纯化的NS5B-C21蛋白浓度相对较高,选用此蛋白用于NS5B RNA聚合酶活性分析。对获得的三种蛋白的抗原性进行了分析,间接ELISA法检测已知的HCV抗体阳性及阴性血清,显示三种蛋白均有较好的抗原性和特异性,提示该蛋白不仅可用于酶活性分析,也可能用于抗体检测及研制检测试剂。将纳米磁分离、酶联等技术相结合,利用表达的NS5B蛋白,建立了一种体外检测NS5B RNA聚合酶活性的新方法。将RNA模板修饰固定在核壳结构复合磁性纳米颗粒上并加入磁分离微孔反应管内,再加入引物,纯化的NS5B蛋白酶,NTP,Bio-11-UTP等反应体系。通过掺入生物素标记单体,利用NS5B蛋白的RNA依赖的RNA聚合酶的活性,使另一条RNA链得到延伸,在外磁场下分离除去非特异性吸附片段,再与酶标记的亲和素结合,洗涤后,向微孔内加入底物显色剂,通过是否显色来判定NS5B蛋白酶活性。该方法可直接通过显色来检测NS5B的RNA聚合酶活性,并且可以在96孔板内进行高通量检测,为高通量筛选NS5B蛋白酶抑制剂奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 HCV NS5B全长基因及几种截短形式的克隆表达
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 分析与讨论
• 第二部分 HCV NS5B全长基因及几种截短形式的纯化鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 分析与讨论
• 第三部分 RCV NS5B蛋白酶体外活性测定新方法的建立
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 分析与讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述及参考文献