表皮葡萄球菌肽脱甲酰基酶基因功能的研究

论文摘要

表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）是一种寄居在人体表面的正常菌群,通常情况下不会引起致病,是一种机会致病菌,近年来在临床上由于各种人工医疗材料的使用（如静脉插管,导尿管等）,表皮葡萄球菌致病的报道日益增多,表皮葡萄球菌的感染日益加剧,目前已经成为院内感染的前四大病原体之一。加上近年来抗菌药物的滥用,导致临床上耐药菌株,多重耐药菌株层出不穷,研究新型抗表皮葡萄球菌的药物迫在眉睫。肽脱甲酰基酶（peptide deformylase, PDF）是目前发现的抗菌药物靶点之一。在表皮葡萄球菌ATCC 35984和12228基因组比较分析的基础之上,发现两株菌均含有两个编码肽脱甲酰基酶的基因,def和def2,分别编码SePDF1和SePDF2蛋白,我们对其进行了研究。肽脱甲酰基酶广泛存在于真细菌中,是蛋白质合成过程中不可或缺的关键酶。原核生物蛋白质的合成起始于甲酰化的甲硫氨酸tRNA（f-Met-tRNA）,当N端的肽链从核糖体中释放的时候,肽脱甲酰基酶切除甲酰基,继而MAP （methionine aminopeptidase）切除N端的甲硫氨酸,肽链方可正确的折叠。在真核生物蛋白合成过程中,不需要肽脱甲酰基酶的功能,因此细菌的肽脱甲酰基酶可以作抗菌药物的靶点。为了研究以表皮葡萄球菌肽脱甲酰基酶为靶标的可能性,本文利用基因克隆技术,从表皮葡萄球菌ATCC 35984菌株中克隆了两个具有肽脱甲酰基酶PDF特征的基因def和def2,编码产物分别为TypeⅡ型的SePDF1和TypeⅠ型的SePDF2,体外重组表达了SePDF1和SePDF2蛋白。通过甲酸脱氢酶偶联的方法建立了肽脱甲酰基酶酶活检测的方法,结果显示SePDF1为具有活性的表皮葡萄球菌的肽脱甲酰基酶,我们对其结合不同离子的蛋白活性进行了比较,而SePDF2不具有肽脱甲酰基酶活性,我们构建了其酶活部位突变体对其进行了初步分析。第一章表皮葡萄球菌肽脱甲酰基酶1的功能研究为了研究表皮葡萄球菌肽脱甲酰基酶1的功能,以表皮葡萄球菌ATCC 35984菌株的基因组为模板,通过PCR扩增出def基因,长度为522bp。将其连接到克隆表达载体pET-22b中,并转化大肠杆菌BL21 （DE3）,通过IPTG的诱导,可以获得含6×His的体外表达重组SePDF1蛋白。利用6×His与Ni-NTA的高亲和力,纯化得到SePDF1蛋白。由于Fe2+离子体外的不稳定性,所以实验采用Co2+,Ni2+, Zn2+三种二价离子来代替Fe2+离子,对SePDF1蛋白进行体外的研究。首先利用向LB培养基中加入Co2+, Ni2+, Zn2+三种离子的方法来获得含单一离子的SePDF1蛋白,但随后的原子吸收光谱实验表明,由于LB培养基中各类离子成分复杂,用这种方法获得的SePDF1蛋白中各种离子的含量较杂,纯化得到的蛋白并非只含单一离子。因此改用成分可控的限制性培养基培养细菌,向限制性培养基中加入Co2+, Ni2+, Zn2+三种离子培养细菌可以获得高纯度的只含有单一Co2+或Zn2+离子的SePDF1,而加入Ni2+离子的培养基纯化得到的SePDF1中并不能测到的Ni2+存在,推测原因是由于Ni2+对SePDF1的亲和力较低引起。利用FDH（甲酸脱氢酶）偶联的方法,采用N端甲酰化的三肽f-MAS作为底物,对获得的三种SePDF1进行酶活检测发现含Co2+离子的SePDF1蛋白活性最高,而Ni2+, Zn2+-SePDF活性较低。而与SePDF1高度同源的金黄色葡萄球菌肽脱甲酰基酶（SaPDFB）的Ni2+形式活性最强,说明金属离子对PDF酶催化活性的关键作用,通过对SePDF金属离子结合位点的关键氨基酸进行突变（C111S）也验证了这一说法,突变后的SePDF1由于金属离子结合能力的丧失,失去了活性。对活性最高的Co-SePDF1进行酶动力学参数测定,采用Lineweaver-Burk双倒数法计算得到其Km值为2.227 mM, kcat/Km为6.3×104M-1*sec-1。而快速蛋白液相色谱（FPLC）实验表明,SePDF1在溶液状态中以单体状态存在。结合实验室已有的SePDF1蛋白晶体结构,采用计算机高通量虚拟筛选小分子先导化合物库,得到了88个具有潜在抑制SePDF1酶活性的小分子先导化合物,采用128μg/ml的浓度对88个小分子化合物的抑菌浓度进行初筛,其中6个对表皮葡萄球菌具有抑制效果,进一步检测发现其中两个化合物均对表皮葡萄球菌35984有较强的杀菌效果,然而在酶活抑制实验中,则发现这6个小分子化合物均无抑制SePDF1的活性,且对真核细胞具有毒性,说明此小分子化合物不能作为抗菌药物研发的先导化合物。第二章表皮葡萄球菌肽脱甲酰基酶2基因功能的初步研究肽脱甲酰基酶行使功能的前提是Met-tRNA在甲酰基转移酶的作用下发生甲酰化,而表皮葡萄球菌的甲酰基转移酶编码基因fmt与def2基因在基因组上紧密相邻,并且革兰氏阴性菌株的肽脱甲酰基酶基因分布也是同其fmt基因紧密相邻。生物信息学分析显示def2编码的SePDF2属于TypeⅠPDF,并且RT-PCR检测结果显示def2基因在表皮葡萄球菌ATCC 35984菌株生长过程中可持续表达。为了研究SePDF2功能,本实验将def2基因的PCR的扩增产物插入原核表达载体pET-24+,表达的融合蛋白SePDF2-His通过Ni-NTA亲和层析纯化获得高纯度的重组蛋白。然而,利用SePDF1酶活测定法检测,结果显示SePDF2不具有肽脱甲酰基酶的活性。通过氨基酸序列的比对,发现SePDF2蛋白在PDF活性中心的三段高度保守的序列上均有氨基酸的差异,将此序列上氨基酸差异位点按照具有活性的枯草杆菌PDF序列进行改变（A44G, A45V, A46G, I47L, S48A, S90C, I91L, L131Q, M133E）,尽管改变后的SePDF2在催化中心的三段基序上与枯草杆菌BsPDF1 （阳性菌TypeⅠ）完全一致,仍未能使SePDF2获得肽脱甲酰基酶活性。def2基因在细菌生长过程中持续转录却不表达,其在细菌中的功能有待于进一步研究。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 表皮葡萄球菌肽脱甲酰基酶1功能的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二章 表皮葡萄球菌肽脱甲酰基酶2功能的初步研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 论文总结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 致谢