苦马豆素单克隆抗体的制备及鉴定

论文摘要

免疫分析技术（Immunoassay,IA）是以抗原和抗体的特异性结合反应为基础的分析技术,具有灵敏性高、特异性强、检测迅速和成本低廉等特点,在药物、毒素分析和环境污染物检测等领域得到了广泛应用。抗体作为各种免疫分析的核心试剂,对免疫分析的灵敏度、特异性等起着至关重要的作用。单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）是由单个细胞增殖形成的细胞群所产生的抗体,只针对抗原的某一决定簇有特异性免疫反应,其性质纯、效价高、特异性强,可以避免血清学上的交叉反应,且检测低限可达纳克或皮克水平。大多数药物、毒素和环境污染物的分子质量小于1000u,属于半抗原,可与其特异性抗体结合形成半抗原-抗体复合物,但是其本身不具有免疫原性,用此类半抗原与大分子质量载体偶联制备成人工免疫原免疫动物,用杂交瘤细胞制备技术制备针对半抗原的特异性单克隆抗体,应用于医学、免疫学和生物学等许多研究领域,显示出巨大的应用价值和潜力。疯草的主要有毒成分—苦马豆素（swainsonine,SW）,分子量小（173）,属于半抗原,将其与大分子载体化学合成为免疫原,能诱导机体产生特异性抗体,使免疫学检测SW和免疫学防治家畜疯草中毒成为现实。本研究拟用人工合成抗原SW-HSA免疫Balb/C小鼠,达到一定效价后取脾脏制备免疫脾细胞,利用单克隆抗体技术制备分泌SW特异性抗体的杂交瘤细胞,进一步制备出SW单克隆抗体,为免疫学检测SW和免疫学防治家畜疯草中毒奠定基础,研究取得如下结果。1将合成的SW-HSA抗原免疫4只Balb/c小鼠,共免疫4次,间接ELISA测定小鼠血清中SW抗体。结果表明,第3次免疫后,测定各小鼠血清中抗体效价分别为27、26、26、26,第4次免疫后,抗体效价分别为29、28、28、28,试验获得了抗体效价较高的免疫小鼠。2无菌采取免疫小鼠的脾脏制备脾细胞,与SP2/0细胞进行了3次融合,其中第1次融合率较高,为36.7%。3间接ELISA检测有克隆孔的细胞培养上清中抗体效价,筛选阳性孔细胞,第1次融合的细胞阳性率较高,为7.095%。4阳性孔的细胞经3次单克隆培养后,获得了1株生长稳定、能大量分泌抗SW单克隆抗体的杂交瘤细胞,该细胞培养上清中抗体效价为26,命名为1C3。5用秋水仙素阻抑法对杂交瘤细胞的核型进行了分析,1C3株细胞染色体数目为45～50对之间,接近2种亲本细胞染色体数目总和,证明确为两种亲本细胞融合后的杂交体。6 Balb/c小鼠腹腔注射1C3株杂交瘤细胞,收集腹水,ELISA测定腹水中SW抗体效价为211。7硫酸铵沉淀法将3 mL腹水进行单克隆抗体的粗提,得到的粗提物溶液用抽真空冷冻干燥。SDS-PAGE凝胶电泳分析粗提单抗的组分,可见主要呈现两条带,分子量约为55 ku和26 ku,分别与抗体的重、轻链分子量大小一致。8间接ELISA测定单克隆抗体相对亲和力,以被检单克隆抗体的不同浓度为横坐标,以相应的OD490nm值为纵坐标,绘制单克隆抗体相对亲和力测定曲线图,测得单克隆抗体的相对亲和力为56μg/mL。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述
• 第一章 半抗原单克隆抗体的研究进展
• 1.1 半抗原单克隆抗体的制备
• 1.1.1 人工抗原的制备
• 1.1.2 杂交瘤技术制备半抗原的单克隆抗体
• 1.2 半抗原单克隆抗体的应用
• 1.2.1 在药理学研究及临床中的原理和应用
• 1.2.2 在监控兽药和外源激素在动物性食品中残留方面的应用
• 1.2.3 在检测农药在食品中残留方面的应用
• 1.2.4 在生物毒素检测中的应用
• 1.3 半抗原单克隆抗体在应用中存在的问题及前景
• 第二章 苦马豆素的免疫学研究
• 2.1 免疫学基础
• 2.1.1 SW 免疫的免疫学基础
• 2.1.2 SW 免疫的关键问题
• 2.2 SW 人工抗原合成的研究
• 2.2.1 常用载体
• 2.2.2 合成SW 人工抗原的方法
• 2.3 SW 免疫的研究及应用
• 2.4 结语
• 试验研究
• 第三章 苦马豆素-HSA 小鼠免疫试验
• 3.1 材料
• 3.1.1 试验动物
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 试验仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 小鼠免疫
• 3.2.2 血清分离
• 3.2.3 抗体的检测
• 3.3 结果与分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 SW-HSA 免疫小鼠
• 3.4.2 SW-HSA 免疫小鼠抗体效价的测定方法
• 3.5 小结
• 第四章 杂交瘤细胞的制备、筛选及克隆化
• 4.1 材料
• 4.1.1 试验动物
• 4.1.2 骨髓瘤细胞
• 4.1.3 试验试剂
• 4.1.4 培养基
• 4.1.5 试验仪器及器材
• 4.2 方法
• 4.2.1 SP2/0 细胞的培养其对 HAT 培养基敏感性试验
• 4.2.2 饲养层细胞的制备
• 4.2.3 细胞融合
• 4.2.4 杂交瘤细胞的筛选
• 4.2.5 杂交瘤细胞抗体的检测
• 4.2.6 阳性孔杂交瘤细胞克隆化
• 4.2.7 阳性孔杂交瘤细胞的单克隆培养
• 4.2.8 杂交瘤细胞染色体的分析
• 4.2.9 细胞的冻存
• 4.2.10 杂交瘤细胞分泌抗体的检测
• 4.3 结果和分析
• 4.3.1 SP2/0 细胞的培养及其对 HAT 培养基敏感性试验
• 4.3.2 饲养层细胞的制备
• 4.3.3 细胞融合
• 4.3.4 杂交瘤细胞分泌抗体的检测
• 4.3.5 阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆
• 4.3.6 杂交瘤细胞染色体分析
• 4.4 讨论
• 4.4.1 细胞融合
• 4.4.2 阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆培养
• 4.4.3 关于单克隆抗体制备中的检测方法
• 4.5 小结
• 第五章 SW 单克隆抗体的制备及鉴定
• 5.1 材料
• 5.1.1 试验动物
• 5.1.2 试验试剂
• 5.1.3 培养基
• 5.2 方法
• 5.2.1 小鼠预处理
• 5.2.2 杂交瘤细胞的准备
• 5.2.3 小鼠腹水的制备和收集
• 5.2.4 腹水中单克隆抗体效价测定
• 5.2.5 腹水中单克隆抗体的粗提
• 5.2.6 腹水中单抗初步粗提物 SDS-PAGE 分析
• 5.2.7 单克隆抗体相对亲和力测定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 小鼠腹水的制备和收集
• 5.3.2 腹水中单克隆抗体效价测定
• 5.3.3 腹水中单抗粗提物SDS-PAGE 分析
• 5.3.4 单克隆抗体相对亲和力测定
• 5.4 讨论
• 5.4.1 腹水中单克隆抗体的粗提
• 5.4.2 单克隆抗体的亲和力测定
• 5.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介