论文摘要
籽粒硬度是重要的小麦品质性状之一,严重影响润麦加水量、出粉率、破损淀粉粒数量和面粉颗粒度大小,并最终决定磨粉品质和食品加工品质,是国内外小麦市场分级和定价的重要依据之一。本试验以河南农业大学小麦育种研究室提供的278份黄淮麦区的地方品种、当前主栽品种和小麦区域试验新品系为材料,利用单籽粒谷物特性测定仪（SKCS）、特异性引物的PCR扩增、限制性内切酶技术、DNA克隆和测序技术以及实时荧光定量PCR的方法,对所有试验材料的产量相关性状、籽粒硬度表型、Puroindo1ine基因型及其Puroindo1ine b-2的不同等位变异类型进行了鉴定与分析。同时,以来自我国和CIMMYT的12份普通小麦品种为材料,采用引物步移的方法研究PINA蛋白缺失的分子机理以及开发相应的功能性标记。本文主要结论如下:1.黄淮麦区小麦品种以硬质类型为主,其硬度变异范围较广。参试品种中,硬质麦比例高达57.4%,而混合型和软质麦比例则分别仅为8.9%和33.7%,SKCS硬度指数范围为-2～78.6。硬质麦的Puroindo1ine基因型检测中,共检测到Pinb-D1b、Pinb-D1p、Pina-D1b和Pina-D1l四种已知类型,其中Pinb-D1b所占比例最高,占79.4%,其次是Pinb-D1p,为12.4%,而Pina-D1b和Pina-D1l则分别仅为4.1%和1.0%。参试的109份黄淮麦区小麦新品系中,硬质麦所占比例更高,达到61.5%,而混合型和软质麦比例分别仅为15.6%和22.9%,硬质麦的Puroindo1ine基因型检测中,只检测到Pinb-D1b、Pinb-D1p和Pina-D1b三种类型,其中Pinb-D1b所占比例最高,占86.5%,而Pinb-D1p和Pina-D1b则分别仅为7.5%和6.0%。因此,建议黄淮海地区的小麦育种中应适当扩大基因资源的利用范围,如在优质品种的培育过程中进一步采用Pinb-D1d、Pinb-D1e和Pinb-D1g等相对优异的基因类型作亲本,从而能够加快优质小麦品种的培育进程。2.采用引物步移技术对PINA蛋白缺失中的主体类型Pina-D1b类型进行了分子机制研究,发现该类型与野生型的Ha位点相比,从第23个碱基（相对于Pina基因的ATG）开始有一个15, 380 bp的大片段缺失,并在缺失片段两侧设计引物后进行扩增,成功开发出了能够直接在分子水平上进行检测Pina-D1b类型的功能性分子标记Pina-N1。该标记可代替先前检测Pina-D1b类型应用较为广泛的SDS-PAGE技术,在DNA水平上直接检测出PINA蛋白缺失类型,从而能够极大地提高检测效率和降低检测成本。3.在地方品种江东门（江苏）、和尚头（河南）、红蜷芒（河南）中发现了一种新的PINA蛋白缺失类型,将其命名为Pina-D1r。采用引物步移技术对其分子机制研究发现,与野生型相比,Pina-D1r类型的Ha位点有一个10, 415 bp的大片段缺失,其缺失位点从-5117 bp到+5298 bp（相对于Pina基因的ATG）。依据其分子特征开发了能够跨越缺失体的功能性标记Pina-N2,该标记能够直接在分子水平上进行检测Pina-D1r类型。4.进一步对Puroindo1ine b-2基因的变异类型检测表明,所有供试的246份材料（不包括混合型）在Puroindo1ine b-2位点上都含有Pinb-D2v1和Pinb-A2v4两种基因,所有调查品种中,有58个品种是Pinb-B2v2变异类型,占所调查总数的23.6%;而剩余的188个品种中都是含有Pinb-B2v3类型,占所调查总数的76.4%。因此,在黄淮麦区小麦中,Pinb-A2v4/Pinb-B2v3/Pinb-D2v1组合是Puroindoline b-2基因中是最为常见的类型。在软质小麦品种（Pina-D1a/Pinb-D1a）中,含有Pinb-B2v3变异品种的SKCS平均硬度指数（27.2）显著高于Pinb-B2v2变异（22.2）,而硬质小麦中分别含有Pinb-D1b或Pinb-D1p基因类型的亚组中,Pinb-B2v2和Pinb-B2v3变异的分组对籽粒硬度没有显著差异,因此,就籽粒硬度而言,Puroindoline b-B2位点变异对软质小麦的影响比硬质小麦更大。进一步对位于普通小麦B组Puroindo1ine b-B2的两个基因型进行产量相关性状分析后发现,拥有Pinb-B2v3变异的小麦品种在穗粒数、单穗粒重、旗叶长和旗叶面积上都显著高于拥有Pinb-B2v2变异类型的小麦品种,同时Pinb-B2v3变异类型的千粒重、小穗数、粒长、粒宽和旗叶宽等性状也略高于Pinb-B2v2变异类型,表明Pinb-B2v3变异类型的相关产量农艺性状略优于Pinb-B2v2类型。5.对Puroindo1ine b-B2位点的不同等位变异进行荧光定量,结果表明,Pinb-2v3变异类型的小麦中mRNA相对表达量显著高于Pinb-2v2变异类型的小麦的表达量,三种不同类型的Pinb-2v3等位变异类型中,Pinb-2v3b的相对表达量最高,而本实验先前表明,拥有Pinb-2v3类型的小麦品种产量相关性状明显优于拥有Pinb-2v2类型的品种,从而推测认为,Puroindo1ine b-B2基因的表达量可能与小麦产量相关性状的优越性呈正相关关系。进一步对不同组织中的Pinb-B2v基因表达量进行研究表明,Puroindo1ine b-B2基因在叶片中的表达量显著高于其在根中的表达量。