秋眠及非秋眠紫花苜蓿转录组测序及秋眠相关差异基因的筛选

论文摘要

紫花苜蓿是一种优质的多年生豆科牧草,在世界范围内广泛种植。紫花苜蓿的秋眠性是-种适应性生长特性。由于苜蓿的秋眠性与抗寒性呈显著正相关,故前人的研究多集中在不同秋眠型苜蓿与抗寒性有关的物质代谢上。但近年来的研究表明,苜蓿的秋眠性和抗寒性是两个独立的性状。为了研究在紫花苜蓿秋眠过程中哪些基因可能调控或参与了这一过程,我们采用转录组测序技术对两个不同秋眠型的紫花苜蓿品种在不同季节取样,并进行了测序,随后对紫花苜蓿的转录组测序数据进行了组装与注释,进行了信息学分析,并筛选出了潜在的、与紫花苜蓿秋眠性相关的差异基因。本试验共产生了1 60000000条高质量的测序读段（2x1 00 bp）,所有这些测序数据采用Trinity软件组装成一条转录组作为参照转录组,转录组中包含了192875条转录本,平均序列长度为856 bp。同时使用MISA软件鉴定出了41973条简单序列重复。通过blastx对紫花苜蓿转录组与其它1 5种已测序植物的蛋白质组进行比对得出了该试验中紫花苜蓿转录组的保守性；通过hmmer软件与植物转录因子数据库鉴定出1350条转录本含有转录因子。最后还对紫花苜蓿四个条件下选定的两两之间的差异表达基因作了分析,以变化倍数在两倍（上调和下调）或以上且调整后的P值小于0.01作为差异基因的筛选条件,每组中有176至521个差异基因不等,差异基因中有已知的和未知的基因,通过结合代谢通路找到与秋眠性可能相关的基因,以及选择差异表达较高的未知基因作为候选基因,为以后研究紫花苜蓿的秋眠机理打开了一个新的突破口。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 紫花苜蓿的营养价值
• 1.1.1 粗蛋白质
• 1.1.2 碳水化合物
• 1.1.3 维生素
• 1.1.4 紫花苜蓿中的功能成分
• 1.2 紫花苜蓿的秋眠性
• 1.3 紫花苜蓿秋眠性机理研究
• 1.4 测序技术的发展
• 1.4.1 第一代测序技术
• 1.4.2 高通量测序技术
• 1.4.2.1 Illumina测序平台
• 1.4.2.2 Roche测序平台
• 1.4.2.3 ABI测序平台
• 1.4.3 几种测序技术的比较
• 1.4.4 转录组测序
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.2 技术路线
• 3.3 试验主要仪器设备与试剂
• 3.3.1 仪器设备
• 3.3.2 主要试剂
• 3.4 测定指标与方法
• 3.4.1 RNA提取
• 3.4.2 RNA浓度及OD值的测定
• 3.4.3 RNA凝胶电泳
• 3.4.4 cDNA文库的构建及测序
• 3.4.5 转录组的组装
• 3.4.6 比对、定量和注释
• 3.4.7 GC含量和SSR的发掘
• 3.4.8 序列保守性分析
• 3.4.9 转录因子编码基因的鉴定
• 3.4.10 基因表达分析
• 3.4.11 荧光定量PCR验证
• 4 结果
• 4.1 测序原始数据
• 4.2 测序数据及转录组的组装
• 4.3 转录组的基本信息
• 4.4 简单重复序列的鉴定
• 4.5 序列保守性和功能注释
• 4.5.1 序列保守性分析
• 4.5.2 功能聚类
• 4.5.3 KEGG代谢通路
• 4.6 转录因子编码基因
• 4.7 差异表达基因的筛选
• 5 讨论与结论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 附表