论文摘要
成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptors, FGFRs）属于受体酪氨酸蛋白激酶（receptor tyrosine kinase, RTK）家族。目前已发现4种FGFRs,即FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4。它们之间在氨基酸水平有55%72%的一致性。既往研究表明,FGF/FGFRs信号通路与骨骼发育、再生和骨骼疾病有密切联系。FGFR1、2、3功能增强或丧失突变可导致包括颅缝早闭（craniosynostosis, CS）、软骨发育不全（achondroplasia, ACH）和CATSHL （camptodactyly, tall stature, scoliosis, and hearing loss）综合征在内的多种人类骨骼系统遗传性疾病。骨骼的发育是通过软骨内成骨（endochondral ossification）和膜内成骨（intramembranous ossification）两种方式来完成的。软骨内成骨又经过软骨形成（chondrogenesis）和骨形成（osteogensis）两个密切相关的过程。而膜内成骨则是一个单独的骨形成的过程,即间充质密集后直接分化为成骨细胞并成骨。不同的FGFRs在软骨形成和骨形成过程中的作用不一致。总的讲,目前认为FGFR1、2主要调节膜内成骨过程,而FGFR3则主要参与调控软骨内成骨。已发现人类FGFR1（P252R）功能增强点突变和多种FGFR2功能增强点突变可影响颅缝膜内成骨过程,导致颅缝提前闭合,引起囟门早闭综合征;而FGFR3功能增强点突变通过抑制生长板软骨发育,导致软骨发育不全等软骨发育障碍性疾病。FGFR3和FGFR1、2高度同源,也受可调节骨形成的内源性配体FGF2、18等激活,提示FGFR3可能参与调控骨形成过程。而人类FGFR3 A391E功能增强型点突变可引起Crouzon等囟门早闭征,则是FGFR3影响骨形成的直接证据。模拟人ACH的FGFR3突变小鼠出生后15天长骨骨小梁处成骨细胞分化标志基因Cbfa1等表达水平增高,成年期骨量减少;FGFR3敲除小鼠骨量减少,骨小梁矿化障碍。这些结果均提示FGFR3可影响成骨细胞功能和骨形成过程。目前已有多名学者报道利用条件性基因敲除小鼠研究FGFR1、2对成骨细胞的直接调控作用,但关于FGFR3对成骨细胞及骨形成的直接调控作用及机制还不完全清楚。骨损伤后的再生修复是局部骨骼的再发育过程。一些参与调控骨骼发育的分子如IHH/PTHrP、BMPs、Wnt等在骨再生过程中也起着重要调控作用。研究发现,FGFR3参与调节骨损伤后的再生过程,且在一定程度上,FGFR3对骨再生和骨生长发育中的软骨内成骨过程可能发挥相似的负性调控作用。而Rundle等发现FGFR3表达于骨折部位成骨细胞和骨膜下间充质细胞,提示FGFR3直接参与调控骨再生过程中的成骨细胞骨形成过程。那么FGFR3在骨再生过程中对成骨细胞骨形成的影响是否与FGFR3在成年期骨重建中的作用类似呢?据此,本课题用成骨细胞特异性表达FGFR3功能增强点突变（FGFR3 K644E,Oc-cre）小鼠和模拟人软骨发育不全的FGFR3功能增强点突变(FGFR3G369C/+)小鼠两种基因敲入小鼠模型为研究对象,探讨生理和病理（骨损伤）情况下,FGFR3对成骨细胞及骨形成的直接调控作用。主要研究内容第一部分:成骨细胞特异性表达含功能增强点突变FGFR3对成年期小鼠骨形成的影响1.对成骨细胞特异性表达FGFR3功能增强点突变（FGFR3K644E,Oc-cre）小鼠身长,尾长,体重等形态学指标进行大体观察。2.利用藏红固绿染色观察新生小鼠胫骨生长板软骨发育情况。3.利用X线摄片和Micro-CT观察成年小鼠股骨骨密度及骨组织结构的变化。4.通过H&E染色、钙绿素双标实验观察小鼠胫骨骨小梁的结构及矿化情况;测定血清钙磷含量,了解体内钙磷水平是否受骨骼代谢异常影响;定量PCR检测成骨细胞分化标志基因Cbfa1、OC、OP、Col1a1等的表达变化。5.小鼠颅骨成骨细胞分离培养,测定生长曲线并进行成骨诱导。通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色观察,结合检测成骨相关基因Cbfa1、OC、OP、Col1a1以及FGFR1、FGFR2和BMPRIA的表达,观察成骨细胞分化和矿化情况。6.通过TRAP染色观察胫骨破骨细胞形成及活性。第二部分:FGFR3功能增强对小鼠胫骨骨皮质损伤修复过程的影响1.建立FGFR3功能增强小鼠(FGFR3G369C/+)胫骨皮质缺损模型。2.利用H&E染色和Micro-CT重建分析观察骨再生情况。3.定量PCR检测新生骨组织中成骨细胞分化相关基因Cbfa1、OC、OP、Col1a1等mRNA水平表达变化。主要实验结果一. FGFR3K644E,Oc-cre小鼠骨形成增加,体型变小1.成年期（2月龄）FGFR3K644E,Oc-cre小鼠体型变小,体重减轻;新生小鼠长骨生长板软骨发育无异常。2.成年期FGFR3K644E,Oc-cre小鼠骨量增多,骨形成增加X线摄片显示FGFR3K644E,Oc-cre小鼠股骨放射密度增高;Micro-CT扫描显示FGFR3K644E,Oc-cre小鼠BV/TV,骨小梁数量（ Tb.N）及骨小梁厚度（ Tb.Th）均显著升高;H&E染色FGFR3K644E,Oc-cre小鼠干骺端和骨骺部位骨小梁较野生小鼠明显增多、增长、增粗。提示成年期FGFR3K644E,Oc-cre骨量增多,骨形成增加。3. FGFR3K644E,Oc-cre小鼠成骨细胞分化增强,矿化障碍1) 2月龄FGFR3K644E,Oc-cre小鼠胫骨骨组织中成骨细胞分化标志基因Cbfa1、OP和Col1a1表达上调,表明成骨细胞分化增强;钙绿素双标实验提示FGFR3 K644E,Oc-cre小鼠矿化能力减弱;体内血清钙磷含量正常,提示骨骼矿化障碍没有影响全身钙磷水平。2) FGFR3K644E,Oc-cre小鼠颅骨成骨细胞增殖减慢;经成骨诱导培养后碱性磷酸酶表达增加,钙结节形成减少;成骨细胞分化标志基因Cbfa1、OP、OC、Col1a1表达均显著上调,表明成骨细胞分化增强,矿化降低。3) FGFR3K644E,Oc-cre小鼠成骨相关基因FGFR1、FGFR2及BMPRIA表达下调。4.FGFR3K644E,Oc-cre小鼠破骨细胞骨吸收作用没有改变TRAP染色后计数结果显示FGFR3K644E,Oc-cre小鼠胫骨单位骨小梁面积上的破骨细胞数量与野生小鼠无明显差别,提示FGFR3K644E,Oc-cre小鼠破骨细胞数量及功能无明显改变。二. FGFR3G369C/+小鼠胫骨骨皮质损伤愈合延迟1. FGFR3G369C/+小鼠骨皮质损伤后局部新生骨组织增多Micro-CT扫描重建分析及H&E染色显示FGFR3G369C/+小鼠损伤局部新生骨组织数量和体积较野生小鼠增加;新生骨组织成骨细胞分化标记基因Cbfa1、OP等表达显著上调,提示成骨细胞分化增强。2. FGFR3G369C/+小鼠皮质骨愈合延迟MicroCT扫描重建分析及H&E染色显示在损伤后第21天,野生型小鼠和FGFR3G369C/+小鼠在皮质缺损处都出现了新生板层骨,但FGFR3G369C/+小鼠的新生骨皮质厚度要小于野生小鼠。主要结论1.成骨细胞特异性表达FGFR3功能增强点突变小鼠体型变小,但生长板软骨未见明显异常,提示成骨异常在ACH侏儒体型发生中有一定作用。2.成骨细胞特异性表达FGFR3功能增强点突变小鼠成年期骨形成增加,导致骨量增多。3. FGFR3功能增强促进成骨细胞分化,抑制其矿化。4. FGFR3功能增强对成骨细胞的影响可能部分是通过FGFR1、FGFR2及BMPRIA的继发性改变所致。5. FGFR3功能增强导致小鼠骨皮质缺损愈合延迟。