黑曲霉PZ301产耐酸性α-淀粉酶的固态发酵条件及酶的分离纯化研究

论文摘要

耐酸性α-淀粉酶在低pH值的条件下，以随机方式切断淀粉分子内的α-1,4糖苷键，生成低聚糖、麦芽糖和糊精等，由于其在酸性条件下的稳定性，它在淀粉加工、酿造等行业的应用比普通α-淀粉酶更有优越性。随着淀粉工业的发展，耐酸性α-淀粉酶的应用越来越多，有极大的开发价值。本文对一株产耐酸性α-淀粉酶的黑曲霉PZ301进行了研究。本实验对产耐酸性α-淀粉酶PZ301菌株进行形态学鉴定，根据其菌落形态和产孢结构，真菌PZ301被鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger）。研究了微波化学复合诱变对菌株PZ301的致死效应：NTG浓度为250μg/mL处理90min后，经频率2450HZ、输出功率800W微波辐照30s时，PZ301孢子的致死率为86.6%，正突变率最高。在此条件下对菌株PZ301进行2轮复合诱变，得到1株耐酸性α-淀粉酶活力较高的菌株，酶活力为1.985IU/mL，较出发菌株的酶活力提高了23%。对菌株PZ301产耐酸性α-淀粉酶固态发酵的条件进行了摸索，实验结果表明最佳的培养基组成为：麸皮7g，复合碳源（葡萄糖+淀粉（质量比为1：4））0.28g，（NH4）2SO40.14g；最佳产酶的固态发酵条件：料水比为1∶2，接种量1mL（孢子浓度107个/mL），于35℃条件下发酵72小时，酶活力为40IU/g。比未优化前的酶活力提高55%。建立了核酸与菌丝体之间的定量关系，并以此为基础，测定了PZ301固态发酵中生物量的变化，得到生长曲线。发现在优化培养条件下，PZ301菌株的生物量和耐酸性α-淀粉酶在72h时均达到最高，表明耐酸性α-淀粉酶系同步合成型酶。菌株PZ301固态发酵培养72h后，用5倍体积0.05mol/L pH4.2的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液浸提固态干曲，过滤、离心后得到粗酶液，用饱和度50-80%硫酸铵进行分级沉淀，复溶、离心取上清液；用3%粉末活性碳对上清液进行脱色，离心，对上清液进行超滤（超滤膜为100kDa）。取超滤后大于100kDa以上组分在pH5.4条件下进行Sephadex DEAE A-50离子交换柱层析，收集有耐酸性α-淀粉酶活性的6号峰，除盐浓缩后进行TSK-Gel G4000PWXL柱层析，PAGE电泳得到单一的条带，并通过SDS-PAGE电泳测定分子量，其分子量为58.74KDa。对该酶的酶学性质研究，实验结果表明：粗酶的最适反应温度和pH值分别为50℃和4.2，在pH2.2-8.0范围酶的稳定性较高，半失活温度为65℃。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1.1 淀粉酶
• 1.2 耐酸性 α-淀粉酶
• 1.3 固态发酵
• 1. 引言
• 2.材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 柱材料
• 2.1.3 主要化学试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 试剂的配制
• 2.3 方法
• 2.3.1 麦芽糖标准曲线的测定
• 2.3.2 蛋白质标准曲线测定
• 2.3.3 耐酸性 α-淀粉酶酶活测定
• 2.3.4 真菌 PZ301 的形态学鉴定
• 2.3.5 黑曲霉 PZ301 产耐酸性 α-淀粉酶的诱变
• 2.3.6 生长曲线和产酶曲线的测定
• 2.3.7 耐酸性 α-淀粉酶的酶学性质的研究
• 2.3.8 PZ301-1 产耐酸性 α-淀粉酶的固态发酵条件的研究
• 2.3.9 PZ301-1耐酸性α-淀粉酶的分离纯化
• 3. 结果与分析
• 3.1 菌种的形态学鉴定
• 3.1.1 菌落形态
• 3.1.2 菌株 PZ301 的显微形态
• 3.2 黑曲霉 PZ301 的诱变
• 3.2.1 微波对 PZ301 的致死效应
• 3.2.2 微波-NTG 复合诱变对 PZ301 的致死效应
• 3.2.3 复合诱变
• 3.3 PZ301 产耐酸性α-淀粉酶固态发酵条件研究
• 3.3.1 PZ301 产耐酸性α-淀粉酶发酵培养基优化
• 3.3.2 PZ301 产酸性α-淀粉酶发酵培养条件优化
• 3.4 PZ301 的固态培养发酵动力学
• 3.4.1 菌丝体核酸含量标准曲线
• 3.4.2 PZ301 的发酵动力学研究
• 3.5 耐酸性α-淀粉酶粗酶的酶学性质
• 3.5.1 耐酸性α-淀粉酶的最适反应 pH
• 3.5.2 耐酸性α-淀粉酶的最适反应温度
• 3.5.3 耐酸性α-淀粉酶的 pH 稳定性
• 3.5.4 耐酸性α-淀粉酶的热稳定性
• 3.6 耐酸性α-淀粉酶的分离纯化
• 3.6.1 粗酶液的提取
• 3.6.2 酶的浓缩
• 3.6.3 离子交换层析
• 3.6.4 HPLC 分离纯化
• 3.6.5 纯化鉴定
• 4. 讨论
• 4.1 酶活力提高方法
• 4.2 耐酸性α-淀粉酶的产酶动力学
• 4.3 超滤和脱色
• 4.4 纯化结果的讨论
• 5. 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 在读期间发表的学术论文