我国黄瓜棒孢叶斑病的病原学及诊断技术的研究

论文摘要

多主棒孢（Corynespora cassiicola）是一种重要的植物病原真菌,寄主范围极为广泛。近年来,由该病原菌引起的黄瓜棒孢叶斑病在我国大面积的暴发,造成巨大的经济损失。本论文以我国不同来源的多主棒孢为研究对象,从病原菌的形态特征、致病力分化、遗传多样性等方面,分析我国多主棒孢的种群分化;另一方面建立了多主棒孢的检测技术,为土壤、种子带菌检测和早期诊断提供有效方法。1.2008年至2010年,在我国山东、河北、北京、辽宁、吉林、河南、云南、海南等11个省市区调查棒孢叶斑病的危害,发现棒孢叶斑病已成为近年来我国蔬菜栽培中的重要病害,对黄瓜、番茄和茄子等蔬菜生产造成了巨大的损失。通过组织分离和显微形态鉴定,从黄瓜、番茄和茄子等10种寄主上分离到130株多主棒孢（Corynespora cassiicola）。2.明确了我国茄子棒孢叶斑病病原菌为多主棒孢。通过致病性试验、形态学观察及DNA序列比对,确定我国茄子棒孢叶斑病的病原菌为多主棒孢,而不是日本报道的Corynespora melongenae Takimoto和印度报道的Corynespora melongena Sharma & Srivastava。3.发现我国不同寄主来源的多主棒孢存在明显的致病力分化。通过人工接种,测定不同寄主来源的多主棒孢在黄瓜、番茄和茄子上的致病力,发现寄主来源同致病力分化之间具有显著的相关性。侵染橡胶、番茄、豇豆和一串红等花卉的菌株对非寄主植物无致病力或致病力较弱;侵染黄瓜、茄子、苦瓜的多主棒孢侵染的寄主范围较广。相同寄主和相同地理来源的病原菌群体中致病力存在强、中、弱的差异。4.通过AFLP和ISSR标记分析,发现了橡胶和番茄上的多主棒孢具有寄主专化性。根据AFLP和ISSR的谱带构建不同来源多主棒孢的UPGMA系统发育树,将145个菌株分为两个遗传类群。类群Ⅰ主要是自橡胶上分离到的多主棒孢,与其它来源菌株的遗传距离较远,遗传相似度小。类群Ⅱ为其它寄主来源的菌株,其中番茄上分离到的病原菌遗传相似度极高,被划分在一个亚类群中。5.ISSR分析结果显示多主棒孢遗传类群与地理来源有一定的相关性。依据不同地理来源多主棒孢的ISSR指纹图谱构建UPGMA系统发育树,发现黄瓜上分离的多主棒孢分为2个遗传类群,类群A为海南黄瓜棒孢叶斑病病原菌,类群B是从其它地区分离的菌株,2个类群之间的遗传距离大于0.20,表明海南地区的菌株同其它地区的菌株具有显著差异;东北、华北等内陆栽培地采集的黄瓜棒孢叶斑病病原菌具有高度相似性。6.根据多主棒孢ITS区序列设计了特异性引物CIR5/CIF5,建立多主棒孢的实时荧光定量PCR检测技术。对人工模拟的不同浓度带菌土壤和种子进行检测,表明该技术对土壤中多主棒孢的检测下限为1个孢子/g土壤,1万粒黄瓜种子有1粒带菌即可被检测到。7.以多主棒孢体可溶性蛋白为抗原,制备多克隆抗体,优化斑点免疫吸附（Dot-ELISA）中抗原抗体的反应浓度及作用时间,建立黄瓜棒孢叶斑病的Dot-ELISA检测技术,确定了多主棒孢Dot-ELISA检测的最适反应条件。该技术在田间诊断仅需5h,可在病害潜伏、未显症期进行诊断。本研究首次对我国不同寄主和地理来源的多主棒孢进行病原学研究,发现多主棒孢种内存在寄主专化性,地理环境因素会促进多主棒孢的种群分化;同时建立了多主棒孢的实时荧光定量PCR和斑点免疫检测技术。上述结果为进一步研究黄瓜棒孢叶斑病的流行规律及早期诊断和监测提供了有用的信息和有效的技术手段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 多主棒孢的研究概况
• 1.1.1 多主棒孢的分类地位
• 1.1.2 棒孢叶斑病的危害
• 1.1.3 多主棒孢的侵染途径
• 1.1.4 多主棒孢的寄主范围与致病力分化
• 1.1.5 多主棒孢的遗传多样性研究
• 1.1.6 多主棒孢的寄主选择性毒素cassiicolin
• 1.1.7 棒孢叶斑病的防治
• 1.2 分子标记技术在植物病原真菌研究中的应用
• 1.2.1 几种主要的分子标记技术的比较
• 1.2.2 基于分子标记技术的植物病原真菌群体遗传多样性的研究
• 1.2.3 基于分子标记技术的植物病原真菌系统分类的研究
• 1.3 植物病原真菌快速检测技术的研究进展
• 1.3.1 PCR 技术在植物病原真菌检测中的应用
• 1.3.2 免疫学技术在植物病原真菌检测中的应用
• 1.4 本研究的目的意义和技术路线
• 1.4.1 本研究的目的和意义
• 1.4.2 技术路线
• 第二章 棒孢叶斑病的病害调查及病原鉴定
• 2.1 试验材料
• 2.2 试验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 棒孢叶斑病的标本采集及症状观察
• 2.3.2 病原菌的分离及纯化
• 2.3.3 病原菌的形态特征比较
• 2.3.4 茄子棒孢叶斑病的病原鉴定
• 2.4 小结与讨论
• 2.4.1 我国蔬菜棒孢叶斑病症状的多样性
• 2.4.2 不同来源多主棒孢的形态学比较
• 2.4.3 茄子棒孢叶斑病的病原鉴定
• 第三章 多主棒孢致病力分化的研究
• 3.1 试验材料
• 3.2 试验方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 多主棒孢在不同寄主上的致病力测定
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 多主棒孢的遗传多样性研究
• 4.1 试验材料
• 4.2 试验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 多主棒孢基因组DNA 的浓度与纯度检测
• 4.3.2 多主棒孢基因组DNA 的特异性检测
• 4.3.3 多主棒孢AFLP 体系的建立与引物筛选
• 4.3.4 不同来源的多主棒孢的AFLP 分析
• 4.3.5 多主棒孢ISSR 体系的建立
• 4.3.6 不同来源的多主棒孢的ISSR 分析
• 4.4 小结与讨论
• 4.4.1 分子标记技术在多主棒孢遗传多样性研究中的应用
• 4.4.2 AFLP 和ISSR 标记技术对多主棒孢遗传多样性的研究
• 第五章 土壤和种子中多主棒孢的实时荧光定量PCR 检测
• 5.1 试验材料
• 5.2 试验方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 病原菌基因组DNA 的提取
• 5.3.2 多主棒孢ITS 区序列测定及特异性引物设计
• 5.3.3 引物特异性检测
• 5.3.4 荧光定量标准品的制备
• 5.3.5 荧光定量PCR 标准曲线的建立
• 5.3.6 模拟带菌土壤的实时荧光定量PCR 检测
• 5.3.7 模拟种子带菌的实时荧光定量PCR 检测
• 5.4 小结与讨论
• 第六章 基于斑点免疫的黄瓜棒孢叶斑病的诊断技术
• 6.1 试验材料
• 6.2 试验方法
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 多主棒孢体可溶性蛋白浓度的测定
• 6.3.2 多主棒孢多克隆抗体的制备
• 6.3.3 多主棒孢多克隆抗体的纯化
• 6.3.4 间接ELISA 法对多主棒孢多克隆抗体的特异性和灵敏性检测
• 6.3.5 间接Dot-ELISA 法最佳工作条件
• 6.3.6 间接Dot-ELISA 法田间检测效果的评价
• 6.3.7 间接Dot-ELISA 法对不同侵染时期叶片检测效果的评价
• 6.4 小结与讨论
• 第七章 结论与讨论
• 7.1 全文结论
• 7.2 讨论
• 7.3 创新点
• 7.4 展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历