论文摘要
目的神经病理性疼痛的治疗是临床工作中日益受到重视而又棘手的问题，目前实施的各种治疗方法都存在一定的局限性。转基因镇痛是将外源性基因转移至动物体内表达镇痛物质，从而发挥镇痛效应的一种方法，而脑啡肽作为一种内源性阿片肽类镇痛物质日益受到关注，许多动物实验已证明其有明显的镇痛效应。目前，转脑啡肽基因治疗的关键问题之一在于开发安全、高效的基因转导系统。非病毒载体具有使用方便、可大规模生产以及无免疫原性等优点。其中裸DNA作为最简单的非病毒载体方法是将目的基因连接在表达的质粒上直接注射动物体内，本实验利用基因重组技术将人前脑啡肽原基因（human preproenkephalin gene，hPPE）与真核表达载体pcDNA3.1（+）连接，构建重组质粒pcDNA3.1（+）-hPPE，然后将其直接注射到坐骨神经慢性压迫（chronic constriction injury of the sciatic nerve，CCI）模型大鼠的蛛网膜下腔，观察其对大鼠神经病理性疼痛的镇痛效应。该实验还利用基因重组技术将增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescence protein，EGFP）与真核表达载体pcDNA3.1（+）连接，构建重组质粒pcDNA3.1（+）-EGFP后，将其直接注射到正常大鼠的蛛网膜下腔，观察裸DNA在大鼠体内转染后的时空效应。方法1．蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1（+）-EGFP，观察其在大鼠体内转染后的时空效应。雄性SD大鼠54只被随机分成2组：实验组（n=48）又分8个亚组（24小时、1、2、3、4、5、6、7周组各6只）。空白对照组6只（不做任何处理）。实验组鞘内注射30μg/100μl重组质粒pcDNA3.1（+）-EGFP 100μl。2．建立神经病理性疼痛模型，即坐骨神经慢性压迫（CCI）模型。雄性SD大鼠20只被随机分成2组：CCI模型组（6/0丝线结扎右侧坐骨神经）和CCI模型假手术组（仅暴露出右侧坐骨神经，不做结扎）。CCI术前连续测量3天双侧后爪热刺激缩足反射潜伏期（Paw withdrawal thermal latency，PWTL），术后第5天开始测量，隔日1次，连续测量6周。3．观察重组质粒pcDNA3.1（+）-hPPE的镇痛效应。20只CCI模型鼠被随机分成2组：实验组（CCI模型鼠蛛网膜下腔移入30μg/100μl重组质粒pcDNA3.1（+）-hPPE 100μl）和空质粒组（CCI模型鼠蛛网膜下腔移入30μg/100μl空质粒pcDNA3.1（+）100μl）；鞘内注射后第2到第18天，检测双侧后爪对热刺激缩足反射潜伏期，第8天进行腹腔注射纳洛酮（0.08mg/kg）实验，用药前测量一次，用药后10分钟开始测量，观察用药后1小时内动物双后肢热痛阈变化情况。第18天进行脑脊液灌流检测脑脊液中亮氨酸脑啡肽的含量和采用免疫组化技术测定两组大鼠脊髓背角N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）亚单位NR2B表达的变化。结果1．蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1（+）-EGFP在大鼠体内转染后的时空效应。实验组：鞘内注射重组质粒pcDNA3.1（+）-EGFP 24小时后在大鼠脑脊膜及脊神经的外膜上发现绿色荧光，在大鼠的心、肝、脾、肺、肾及股四头肌上没见到pcDNA3.1（+）-EGFP的表达。对照组：与实验组比较，没发现绿色荧光。重组质粒pcDNA3.1（+）-EGFP在实验组大鼠的表达，7到14天达到高峰，4周后明显下降，第7周消失。并且未发现脊髓神经损伤和动物行为学的改变。2．CCI模型动物后肢热痛阈的变化规律。CCI组结扎侧后爪术后第5天出现自发抬起损伤肢体、时而舔足、咬足或甩足等自发性疼痛；术后第7天出现明显的热痛敏感现象（PTWL降低，P<0.01），持续33天。假手术组手术前后PTWL无明显变化（P>0.05）。3．裸质粒移植镇痛效应。空质粒组在给予pcDNA3.1（+）前后PTWL无明显变化（P<0.05）；实验组基因治疗第3天产生明显的抗伤害效应（PTWL升高，P>0.05），持续镇痛长达18天，且镇痛效应能被纳洛酮翻转。实验组脑脊液灌流液L-ENK含量明显高于空质粒组，具有显著性差异，149.52±17.83 vs 45.55±12.58pg/ml，t=15.581，P=0.001<0.01。正常组大鼠脊髓背角有少量NR2B免疫阳性蛋白表达；与正常组比较，空质粒组大鼠脊髓背角有大量NR2B免疫阳性蛋白表达（P<0.01），实验组大鼠脊髓背角NR2B阳性蛋白表达明显受到抑制（P<0.01）。结论1、裸DNA通过鞘内直接注射法可以被转染至脑脊膜和脊神经外膜，且外源基因得到表达。2、蛛网膜下腔注射重组质粒pcDNA3.1（+）-hPPE能够减轻大鼠神经病理性疼痛的热痛敏行为。