斑马鱼中第二个纤连蛋白基因的识别与表达分析

论文摘要

纤连蛋白是一种高分子量的糖蛋白。作为胞外基质中最为主要的组分之一,纤连蛋白能够与其它多种分子相互作用,参与诸如迁移、粘连、生长、凋亡和分化等细胞活动,在发育和生理过程中发挥重要作用。目前对于哺乳动物、鸟类和两栖类中纤连蛋白的分子和生化特征已有较为详细研究。作为一种重要的模式动物,有关斑马鱼的各种分子生物学特征的描述受到了广泛的重视。 早前报道在斑马鱼中存在一个纤连蛋白基因（FN1a）,而现在我们在斑马鱼中发现了第二个纤连蛋白基因（FN1b）,它编码的蛋白的预期初级结构与在其他脊椎动物中发现的纤连蛋白相似,包含12个Ⅰ型,2个Ⅱ型和17个Ⅲ型重复单元（包括两个可变的剪接位点EⅢA和EⅢB）和一个可变区（Ⅴ）。斑马鱼FN1b与斑马鱼FN1a的氨基酸同源性为62.0%,与人类和爪蟾（Xenopus laevis）的纤连蛋白的同源性分别为54%和55%。通过RT-PCR分析,我们发现同一FN1b转录体的不同剪接会产生EⅢB-和Ⅴ-异构体,但是在斑马鱼胚胎或成体组织中都没有发现FN1b的EⅢA-异构体,也没有发现FN1a的EⅢA,EⅢB或Ⅴ区的剪接异构体。通过RT-PCR检测从原肠胚期（8hpf,受精后8小时）到72hpf的胚胎和不同成体组织中的FN1b mRNA,发现EⅢB-和Ⅴ+是斑马鱼胚胎期中出现的主要形式。与FN1a在原肠胚之前的胚胎期表达量相对较高不同,FN1b在早期卵裂期的表达量非常低。FN1b的多种存在形式以及与FN1a相比不同的表达模式都表明这两个纤连蛋白基因在斑马鱼发育中所发挥的功能不同。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1.1 前言
• 1.2 纤连蛋白的分布
• 1.3 纤连蛋白的组织结构
• 1.4 纤连蛋白的多种异构体形式
• 1.5 纤连蛋白基因的结构
• 1.6 纤连蛋白在脊椎动物生长和发育过程中的功能
• 1.6.1 纤连蛋白在发育中的功能
• 1.6.2 纤连蛋白不同的剪接异构体在胚胎发育中的功能
• 1.7 斑马鱼是研究脊椎动物发育的极好模型
• 参考文献
• 第二章 斑马鱼第二个纤连蛋白基因（fn1b）的分子克隆
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 斑马鱼的饲养
• 2.2.2 斑马鱼总 RNA的抽提
• 2.2.3 从总 RNA中分离m RNA
• 2.2.3 RNA逆转录
• 2.2.4 5'-RACE-PCR
• 2.2.5 End-end PCR
• 2.2.6 DNA片段的切胶回收
• 2.2.7 DNA片段的克隆及测序
• 2.2.8 进化树的构建
• 2.3 结果
• 2.3.1 总RNA抽提
• 2.3.2 5'-RACE结果
• 2.3.3 End-end PCR结果
• 2.3.4 fn1b的基因序列结构
• 2.3.5 fn1b cDNA编码高度保守的纤连蛋白
• 2.4 讨论
• 参考文献
• 第三章 斑马鱼FN1b剪接异构体的鉴定
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 斑马鱼肝脏组织总 RNA的抽提
• 3.2.2 RNA逆转录
• 3.2.3 PCR
• 3.2.4 3'-RACE-PCR
• 3.3 结果
• 3.3.1 EⅢB区剪接情况
• 3.3.2 EⅢA区剪接情况
• 3.3.3 V区剪接情况
• 3.3.4 其它剪接体的检测
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 第四章 斑马鱼FN1b不同异构体的表达
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 斑马鱼总 RNA的抽提
• 4.2.2 RNA逆转录
• 4.2.3 PCR方法检测FN1b异构体的表达
• 4.2.4 构建用来合成整体原位杂交的探针的质粒
• 4.2.5 地高辛标记的 RNA探针的体外合成
• 4.2.6 整体原位杂交
• 4.3 结果
• 4.3.1 FN1b异构体在斑马鱼不同胚胎发育时期的表达
• 4.3.2 FN1b在斑马鱼不同成体组织中的表达
• 4.3.3 fn1b在斑马鱼胚胎中的表达模式
• 4.4 讨论
• 参考文献
• 致谢