论文摘要
费菜Sedum aizoon L.为景天科（Crassulaceae）景天属（Sedum）多年生草本植物,广泛分布于我国陕西、湖北、甘肃、宁夏、江苏、福建等地。费菜以根及全草入药称景天三七,是著名的秦岭“太白七药”之一,具有散瘀止血,安神宁心,解毒镇痛之功效,并可作为野生蔬菜食用。长期以来,由于费菜种质资源的调研工作尚未开展,同时缺乏其生物活性成分与作用机制的研究,使得费菜资源保护与开发利用受到极为不利的影响。本论文在广泛收集费菜种质资源的基础上,从植物形态学和分子生物学对费菜种质资源进行系统研究,同时,对其总多酚、总黄酮、原花色素、脂溶性成分和氨基酸等生物活性成分进行了测定与分析,并探讨了费菜酚类提取物对乳鼠心肌细胞缺血/再灌注的保护作用以及体外抗菌效果,以期为费菜的合理利用提供科学依据。论文的主要研究结果如下:1.对我国陕西、河南、江苏、山东、宁夏、甘肃和北京8个省市自治区开展野外调查与种质收集,系统收集与整理费菜种质资源140份,并建立种质资源圃,实现费菜种质资源圃存保护;制定《费菜种资源描述规范》、《费菜种质资源保存规范》和《费菜种子保存技术规范》等规范标准,建立相应的费菜种质资源收集、整理与保存技术体系;为国家药用植物种质资源平台递交51份代表性种质的标准化信息4488条、图片102张。2.以主要形态特征为基础,对收集到的费菜代表性种质个体的主要形态变异进行观察、描述和统计;通过方差分析,探讨费菜表型特征的遗传多样性。研究表明,费菜的植物形态存在丰富的种内变异,叶型、长阔比、株高、茎粗、花瓣短尖长等方面存在显著差异,变异系数介于21.25%至107.51%之间。3.利用AFLP技术对费菜种质资源进行遗传分析。8对AFLP引物组合从收集的.60份费菜种质样品中共扩增出1467个位点,其中多态性位点1443个,多态百分率为98.36%,每对引物平均扩增183个位点,所有种质样本扩增出24条共有位点。基于个体间Nei’s遗传距离矩阵,采用邻接法进行聚类分析,60个费菜种质个体聚成4个大支;Mantel相关性分析表明,费菜种质资源的遗传距离与地理距离显著相关（P<0.05）。4.对费菜根、茎、叶和果不同部位的总多酚、总黄酮及原花色素含量进行测定。结果表明,费菜中含有丰富的酚类成分,总多酚、总黄酮和原花色素在不同部位的含量分别为:33.97～96.25 mg/g、11.77～40.52 mg/g 及 2.97～17.35mg/g,其中,费菜根部的总多酚与原花色素含量最高,其次为叶、果和茎,而根与叶中总黄酮含量基本一致,叶中略高,最后为果与茎。5.利用GC-MS对费菜不同部位的脂溶性成分进行分析。结果表明,不饱和脂肪酸是费菜主要脂溶性成分,其在根、茎、叶和果不同部位分别占到脂溶性成分的42.59%、52.57%、37.04%和80.06%。每种脂肪酸的相对百分含量在费菜不同部位中存在一定的差异,亚油酸和亚麻酸是不同部位含量最高的两种脂肪酸,含量为 15.44%～44.27%。6.利用酸法测定费菜根、茎、叶和果中的氨基酸组成。结果显示:费菜含有丰富的氨基酸种类,根和果中含有所测定的全部17种氨基酸,叶和茎中含16种氨基酸,其总氨基酸含量为样品干重4.44%～7.20%,不同部位氨基酸含量果>叶>茎>根;四个部位均含有实验所测定的7种人体必需氨基酸,其中,叶片作为费菜主要的食用部位,必需氨基酸与总氨基酸的比值（EAA/TAA）为34.10%,必需氨基酸与非必需氨基酸的比例（EAA/NEAA）为51.74%。7.建立乳鼠心肌细胞缺氧/复氧（H/R）模型,缺氧前给予费菜酚类提取物预处理（FCDF+H/R）,缺氧/复氧后MTT法测定乳鼠心肌细胞生存率,试剂盒法测定乳鼠心肌细胞培养液LDH,Hochest 33342染色法测定乳鼠心肌细胞凋亡率,Griess法测定一氧化氮（NO）,Western Blot测定相关信号通路蛋白表达及磷酸化水平。结果表明,H/R导致乳鼠心肌细胞生存率显著下降,LDH显著上升,凋亡率显著增加,PI3K、Akt和eNOS磷酸化水平升高,NO生成增多,Bcl-2/Bax比值下降,Caspase-3活性增加。1 mg/mL费菜酚类提取物预处理可显著减轻H/R引起的乳鼠心肌细胞损伤（P<0.01）,促进细胞存活,减少LDH产生（P<0.05）,显著降低乳鼠心肌细胞凋亡率（P<0.01）。为明确费菜酚类提取物保护H/R的乳鼠心肌细胞,降低乳鼠心肌细胞凋亡率的具体机制,本论文进一步研究了乳鼠心肌细胞PI3K-Akt-eNOS-NO“生存信号”通路中各信号分子的变化。结果表明,1mg/mL费菜酚类提取物可显著激活H/R引起的乳鼠心肌细胞PI3K表达,并进而提高Akt和eNOS的磷酸化水平,从而增加NO生成（P<0.01）,此效应可被PI3K特异性阻断剂wortmannin抑制（P<0.05）。Bcl-2、Bax和Caspase-3是细胞凋亡发生、发展中的重要信号分子。费菜酚类提取物可显著上调H/R引起的乳鼠心肌细胞Bcl-2/Bax比值,降低Caspase-3活性（P,0.01）,且该作用可被wortmannin抑制（P<0.05）。上述结果提示费菜酚类提取物保护H/R的乳鼠心肌细胞与其激活PI3K/Akt促进乳鼠心肌细胞eNOS的表达、增加NO生成,并增加凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值,抑制Caspase-3活性,进而抑制H/R诱导的乳鼠心肌细胞凋亡有关。该结果也提示Akt及eNOS可能是费菜酚类提取物保护乳鼠心肌细胞的潜在靶点。8.采用牛津杯法和96孔板法测定抑菌圈大小、最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）,比较费菜酚类提取物对金黄色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）、白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）、表皮葡萄球菌（Staphyloccocus epidermidis）等10 种致病菌的抑制作用。结果表明费菜酚类提取物对8种常见的致病菌均表现出较强的抑菌活性,其中金黄色葡萄球菌对提取物最为敏感,其MIC和MBC分别为6.25 mg/mL 和 25 mg/mL。
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标签：费菜论文; 种质资源论文; 形态变异论文; 扩增片段长度多态性论文; 生物活性成分论文;