藻酸双酯钠在内毒素性急性肺损伤和凝血功能障碍中的作用研究

论文摘要

目的研究藻酸双酯钠对脂多糖诱导的小鼠肺微血管内皮细胞损伤和小鼠急性肺损伤模型的保护作用并探讨其可能的机制。方法1、小鼠肺微血管内皮细胞复苏、培养、传代,建立稳定的细胞实验对象。对培养的PMVEC进行CD34细胞化学染色和植物凝集素（BSI）结合试验鉴定。2、采用MTT法检测不同浓度的PSS对正常培养的PMVEC增殖的影响,以确定安全有效的实验用药浓度。MTT法检测PSS对LPS刺激PMVEC的细胞活力的影响。3、将对数生长的PMVEC接种培养板上,随机把细胞分为空白对照组（C组）、LPS刺激组（L组）、PSS+LPS组（LP组）。通过虎红染色法测定测定PMN对PMVEC黏附数量。4、ELISA法检测C组、L组、LP组培养上清液中TNF-α的浓度,免疫细胞化学染色检测各组ICAM-1的表达情况。5、应用Western Blot检测C组、L组、LP组细胞磷酸化p38MAPK和细胞核NF-κB p65的蛋白表达情况。6、应用ELISA法检测C组、L组、LP组培养上清液中PAI-1和t-PA浓度,应用RT-PCR检测PMVEC PAI-1和t-PA mRNA的表达。7、采用尾静脉注射脂多糖复制小鼠急性肺损伤模型,将小鼠随机分为四组：正常对照组（C组）、藻酸双酯钠对照组（P组）、脂多糖模型组（L组）、藻酸双酯钠+脂多糖组（LP组）,每组10只小鼠。静脉给药8h后,收集静脉血和肺组织标本。光镜下观察肺组织病理学变化并予病理评分,测定湿干重比值,ELISA法检测肺组织匀浆TNF-α、ICAM-1浓度和血浆PAI-1、t-PA浓度,免疫组化检测NF-κB p65的表达情况。另取20只小鼠随机分为如上四组,8h后腹主动脉取血用于PT, APTT, TT凝血指标的检测。结果1、复苏后的PMVEC细胞呈梭形或多角形,呈典型“铺路石”样排列,CD34细胞化学染色和植物凝集素（BSI）结合试验阳性。2、PSS在25-200μg·mL-1浓度范围内对体外培养的PMVEC生长具有一定的增殖作用,如果大于400μg·mL-1则对PMVEC的生长具有抑制作用。PSS能部分抑制LPS刺激PMVEC所导致的细胞活力下降。3、与C组比较,L组的PMVEC与PMN的黏附数明显增加（P<0.01）。与L组比较,PSS预处理一个小时,能减低LPS所致的PMVEC与PMN的黏附（P<0.05）。4、结果显示,与C组比较,L组TNF-α和ICAM-1的表达明显增加（P<0.01）；与L组比较,LP组的TNF-α和ICAM-1表达明显降低。5、Western Blot结果显示：与C组比较,L组的PMVEC的磷酸化p38MAPK和胞核NF-κB p65的蛋白表达量明显增高（P<0.01）；与L组比较,LP组的蛋白表达量都明显降低（P<0.05）。6、结果显示：与C组比较,L组PAI-1和t-PA浓度以及PAI-1 mRNA和t-PA mRNA表达量都显著升高（P<0.01）,PAI-1/t-PA比值升高（P<0.01）；与L组比较,LP组PAI-1浓度以及PAI-1 mRNA和t-PA mRNA表达量都降低（P<0.05）, PAI-1/t-PA比值明显减低（P<0.05）。7、与C组比较,L组小鼠W/D比值增大,肺组织表达TNF-α和ICAM-1增高,血浆PAI-1和t-PA浓度增加,PAI-1/t-PA比值增大,肺组织NF-κB p65染色增强,胞核染色增多,IOD值增高（P<0.01）；P组小鼠的上述指标与C组比较无显著差异（P>0.05）；LP组小鼠与L组比较上述指标都显著降低（P<0.01）。凝血指标方面,与C组比较,P组小鼠APTT和TT显著延长（P<0.01）,L组PT、APTT和TT明显缩短P<0.01-0.05)；与L组比较,LP组小鼠PT、APTT和TT都有延长（P<0.01-0.05）。结论1、适当浓度的PSS能对体外培养的PMVEC生长具有一定的增殖作用,浓度过高则对PMVEC的生长具有抑制作用。LPS能对体外培养的PMVEC造成损伤,而PSS能抑制这种损伤,起到保护PMVEC的作用。2、PSS能抑制LPS诱导的PMVEC与PMN之间的黏附。3、PSS能抑制LPS诱导肺微血管内皮细胞ICAM-1和TNF-α的表达。4、PSS能抑制LPS对PMVEC的p38MAPK和NF-κB信号转导通路的活化,对p38MAPK的抑制作用强于对NF-κB的抑制作用。5、PSS能通过降低PAI-1mRNA的转录和蛋白表达,减低LPS对PMVEC纤溶的抑制作用。6、PSS对LPS诱导的小鼠急性肺损伤具有保护作用,其机制与PSS抑制NF-κB活性,促进纤溶活性以及抗凝有关。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 藻酸双酯钠对脂多糖所致小鼠肺微血管内皮细胞损伤的保护作用的研究
• 第一节 正常小鼠肺微血管内皮细胞的培养
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二节 藻酸双酯钠和脂多糖对小鼠PMVEC增殖的影响的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第三节 藻酸双酯钠对脂多糖诱导小鼠PMVEC与中性粒细胞黏附作用的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第四节 PSS对LPS诱导小鼠肺微血管内皮细胞TNF-A和ICAM-1表达的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第五节 PSS对LPS诱导小鼠肺微血管内皮细胞NF-KB和P38MAPK蛋白信号转导通路表达的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第六节 PSS对LPS诱导肺微血管内皮细胞纤溶系统的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 藻酸双酯钠对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤保护作用的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 附图
• 综述
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 致谢