论文摘要
龋病是人类最常见的细菌感染性疾病之一，其发病率高，发病涉及范围广。变形链球菌（Streptococcus mutants）是人类主要的致龋菌，研究表明，变形链球菌拥有大量的毒力因子参与了其在牙面的黏附、聚集、菌斑生物膜的形成、产酸耐酸以及与宿主之间的交互作用。同时，口腔环境中的外界条件如pH、温度、营养以及机体的免疫因子等会随着人体的各种生理病理活动而发生变化，菌斑生物膜中各种微生物之间也随时处在生存竞争之中。因此，如何感应外界环境信号的变化来调节这些毒力因子的转录、翻译、表达，对变形链球菌的生存及致龋都是至关重要的。随着变形链球菌基因组测序的完成，越来越多的毒力因子的功能已逐渐明确，但对一种或几种毒力因子的抑制并不能在体内有效地阻止龋病的进程。因此，对调节这些蛋白的表达及作用的信号网络的研究不但有助于对龋病的发生发展的深入了解，而且针对这些调节因子的干预作用也有望成为龋病预防的新途径。近年来，大量细菌的全基因组测序完成，比较基因组学研究发现一类含有GGDEF结构域的蛋白在各类细菌中几乎普遍存在，进一步研究发现其功能主要是参与c-di-GMP（bis-（3’-5’）-cyclic dimericguanosine monophosphate，单磷酸鸟苷环二聚体）的合成。c-di-GMP近来已被证实是原核细胞信号转导中一类新的第二信使，已有的研究表明它的作用涉及细菌细胞分化、生物膜形成、毒力因子的表达、细胞间通讯以及与宿主细胞间相互作用等多个方面，是细菌生存和代谢中的关键性调节因子之一，但其在变形链球菌中的研究尚属空白。在变形链球菌的生命活动中是否存在c-di-GMP的作用途径?变形链球菌基因组中存在着编码类似GGDEF结构域蛋白的基因，其功能如何?对该蛋白的干预是否会影响表型的改变和毒力因子的表达?对这些问题的回答将有助于加深对细菌信号转导途径的理解，也为探索新的防龋方法提供了依据。本研究共分为三个部分：第一部分：变形链球GGDEF结构域基因的克隆、原核表达、纯化及活性分析常规厌氧培养变形链球菌UA159，提取基因组DNA作为模板，根据GenBank序列设计引物，PCR法扩增gcp基因除信号肽序列外的全长编码区基因片段，连接T载体后转化E coli感受态细胞，挑取阳性克隆，鉴定后测序，结果与GenBank序列完全一致。将测序正确的gcp基因片段定向插入原核表达载体pPROEX HTb，构建原核表达质粒pPROEX HTb-gcp，转化E.coli DH5α感受态细胞，IPTG诱导表达融合蛋白GGDEF，即Gcp蛋白。SDS-PAGE检测表达产物，结果在约77KDa处出现新生蛋白条带，超声裂菌的上清中可见新生蛋白带，表明成功诱导出Gcp蛋白的可溶性表达。使用发酵罐进行表达菌的大体积培养和诱导，超声裂菌，通过金属螯合亲和层析(Ni2+-NTA介质)纯化获得重组表达的Gcp蛋白；western-blot实验证实纯化蛋白可以特异性地与抗His抗体反应。通过HPLC实验结果表明成功获得了有活性的Gcp融合蛋白，该蛋白具有明显促进c-di-GMP合成的能力。第二部分：变形链球菌GGDEF结构域基因失活菌株的构建、鉴定及生物学特性的检测。以变形链球菌UA159基因组DNA为模板，PCR扩增873bp的gcp基因内部序列，连接T载体后将该内部片段定向插入自杀载体pVA8912，酶切鉴定，发现PCR产物及插入片段大小与预期值相符，表明成功构建了打靶载体pVA8912/gcp；将鉴定正确的质粒转化变形链球菌UA159株，挑取阳性克隆，提取基因组DNA，用PCR结合酶切鉴定发现gcp基因失活株基因组中gcp基因内部成功插入了打靶载体片段。结果表明成功构建了变形链球菌gcp基因失活株，为该基因功能的研究奠定了基础。厌氧培养变形链球菌gcp基因失活株，在不同时间点测定OD600值，绘制生长曲线，发现gcp基因失活株和野生菌的生长曲线无显著性差异，表明gcp的基因失活对变形链球菌的生长无显著影响。利用pH5．0～7．0的系列BHI液体培养基厌氧培养gcp基因失活株和野生菌48 h，测量培养前后的pH，观察其产酸性；测量OD600值，观察其耐酸性。结果发现其产酸及耐酸特性有明显差异，说明gcp的基因失活对变形链球菌的产酸耐酸具有显著影响。将gcp失活菌和野生菌悬液转入无菌的96孔酶标板中厌氧培养48 h，黏附菌使用结晶紫溶液染色，乙醇／丙酮混合液显色，测量OD575值，以定量反映生物膜形成量。结果发现gcp失活菌生物膜形成量显著低于野生菌，表明gcp可能与变形链球菌生物膜形成能力有关。荧光标记gcp失活菌和野生菌，与唾液包被的羟基磷灰石粉末共同孵育后，测定羟基磷灰石沉淀的荧光值，比较粘附率的差异，发现gcp失活菌的黏附率（19．7％±0．91）低于野生菌（29．5％±2．9），差异有显著性（P<0．05）；说明gcp失活菌的黏附特性明显的下降。总之，本研究发现gcp的功能主要是与变形链球菌细菌的毒力密切相关，Gcp蛋白通过c-di-GMP信号通路影响变形链球菌的致龋能力。这一研究成果，为揭示变形链球菌致龋的分子机理以及探索新的防龋方法提供了实验依据。