中药复方锡类散促粘膜溃疡愈合作用机制及有效部位群研究

论文摘要

锡类散原载清·尤在泾《金匮翼》,由青黛、珍珠粉、象牙屑、壁钱炭、牛黄、人指甲和冰片组成,具清火解毒、活血止痛、托毒排脓、祛腐生肌之功效,主治咽喉红肿、糜烂、唇舌肿痛等症。现代临床常用于溃疡性结肠炎、口腔溃疡和其它溃疡等。到目前为止,有关锡类散现代药理及有效部位群研究很少。本研究主要拟从细胞水平研究锡类散促溃疡愈合的作用机制及其主要的有效部位群。主要研究内容及结果如下:1.锡类散体外抑菌、镇痛和抗炎试验。①采用纸片法和试管二倍稀释法测定了锡类散体外抑菌效果,结果表明:锡类散体外对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和铜绿假胞菌的最小杀菌浓度（MBC）为12.5mg/mL,对大肠埃希菌的最小杀菌浓度（MBC）为25mg/mL。②采用小鼠热板法和醋酸扭体法测定了锡类散镇痛效果,结果表明:锡类散具有抗炎性镇痛作用。③采用二甲苯诱导的小鼠耳肿胀、角叉菜胶诱导的小鼠足肿胀和棉球诱导的慢性肉芽肿试验测定了锡类散抗炎效果,结果表明:锡类散对急性、亚急性和慢性炎症都有很好的抑制作用。2.采用组织块法建立了小鼠口腔成纤维细胞原代培养体系。结果表明:①接种5天后,组织块边缘开始长出细胞,细胞呈多边形;培养20天后,80%瓶底长满细胞,呈长纺锤状,可传代。②采用MTT法检测不同代数的细胞活力,证明在第六代以内,细胞仍可保持较高的增殖活力,确定本试验所用细胞为第3-4代细胞。③确定最佳接种浓度（96孔板,×200μL）:对于促增殖药的最佳接种浓度为2×104,对于抑制细胞生长的最佳接种浓度为4×104。3.考察了锡类散对成纤维细胞增殖、胶原合成、基质金属蛋白酶-2,9（MMP-2,9）和组织金属蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）的影响。结果表明:①锡类散水提物可显著（P＜0.05）促进成纤维细胞增殖和胶原合成,但其醇提物未达到显著性水平。确定锡类散水提物和醇提物的最低有效浓度为125μg/mL。②锡类散水提物（125μg/mL）和锡类散醇提物（125μg/mL）可显著（P＜0.05）提高MMP-2活性,但对MMP-9活性基本上无影响。③锡类散水提物（125μg/mL）和锡类散醇提物（125μg/mL）都极显著（P＜0.01）增加TIMP-1合成。4.测定了锡类散提取物体外还原力及对H2O2诱导损伤的成纤维细胞的SOD、MDA和NO的影响。结果表明:①锡类散水提物和醇提物本身都有较好的还原力,1000μg/mL锡类散水提物的还原力略高于40μg/mL的维生素C。②确定了在H2O2诱导的成纤维细胞损伤模型中,H2O2诱导浓度为100μmol/mL,诱导时间16小时。③锡类散水提物（125μg/mL）和醇提物（125μg/mL）都能显著提高SOD活性;可极显著（P＜0.01）降低过氧化氢损伤的成纤维细胞的丙二醛释放量;可使细胞NO释放量极显著（P＜0.01）增加。5.考察了锡类散各单味药不同分离部位对成纤维细胞增殖、胶原合成、基质金属蛋白酶-2,9和金属蛋白酶抑制因子-1的影响。初步确定了锡类散七个单味药促成纤维细胞增殖及胶原合成的主要有效部位。试验结果表明:①在锡类散七个单味药不同分离部位中,促成纤维细胞增殖和胶原合成的主要部位有:青黛水提物;珍珠粉大于14KD的组分;象牙屑小于14KD的组分以及人指甲水提物和醇提物。②在锡类散七个单味药不同分离部位中,抑制成纤维细胞增殖和胶原合成的主要部位有:青黛醇提物;牛黄;冰片和壁钱炭醇提物。6.测定了锡类散七个单味药不同分离部位体外还原力及对H2O2诱导损伤的成纤维细胞SOD、MDA和NO的影响。试验结果表明:青黛水提物,人指甲水提物和醇提物有很好的抗氧化作用。本研究结果显示,锡类散促溃疡愈合的作用机制与其促成纤维细胞增殖、胶原合成、MMP—2、TIMP—1以及抗氧化密切有关。在其各单味药不同提取部位中,能促进成纤维细胞增殖、胶原合成、MMP—2和TIMP—1的主要部位有青黛水提物、象牙屑水提物小分子部位、珍珠粉水提物大分子部位以及人指甲水提物和醇提物。青黛醇提物、牛黄和冰片对纤维细胞增殖、胶原合成有抑制作用,但根据相关文献推测这几味药或部位应与抗炎密切相关,同样是溃疡愈合不可缺少的。壁钱炭在本研究中的结果是抑制成纤维细胞增殖和胶原合成,不利于溃疡愈合,对于壁钱炭是否具有其它的与溃疡愈合相关的作用,由于无文献可查,目前不能确定,有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 锡类散处方考证
• 1.2 锡类散复方的研究进展
• 1.3 锡类散单味药的研究进展
• 1.4 创伤修复及慢性溃疡的研究进展
• 1.4.1 正常创伤修复过程
• 1.4.2 慢性溃疡的研究现状
• 1.5 成纤维细胞在创伤愈合中的作用
• 1.5.1 成纤维细胞参与肉芽组织的形成
• 1.5.2 成纤维细胞合成并分泌胞外基质
• 1.5.3 成纤维细胞合成和分泌金属蛋白酶（MMP）及其抑制因子（TIMP）
• 1.6 MMPs和TIMPs在创伤愈合中的作用
• 1.6.1 MMPs的生物学特性
• 1.6.2 TIMPs的生物学特性
• 1.6.3 MMPs的调节
• 1.6.4 MMPs和TIMPs与创伤愈合
• 1.7 氧化应激与慢性溃疡的关系
• 1.8 创伤及慢性溃疡的中西医治疗
• 1.9 本试验研究目的、研究思路及研究内容
• 1.9.1 研究目的
• 1.9.2 研究思路
• 1.9.3 主要研究内容
• 第二章 锡类散抑菌镇痛抗炎药效的研究
• 2.1 材料与设备
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 设备
• 2.1.3 菌种
• 2.1.4 动物
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 给药剂量确定及配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 锡类散体外抑菌试验
• 2.2.2 锡类散镇痛试验
• 2.2.3 锡类散抗炎试验
• 2.2.4 数据统计
• 2.3 试验结果
• 2.3.1 体外抑菌试验结果
• 2.3.2 镇痛试验结果
• 2.4 讨论
• 第三章 小鼠口腔成纤维细胞培养方法的建立
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 动物
• 3.1.2 仪器
• 3.1.3 试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 主要试剂的配制
• 3.2.2 小鼠口腔成纤维细胞的原代培养
• 3.2.3 小鼠口腔成纤维细胞的传代培养
• 3.2.4 成纤维细胞的形态鉴定
• 3.2.5 最佳接种浓度的确定
• 3.2.6 不同传代数的细胞生长能力的检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 原代及不同代的细胞生长情况
• 3.3.2 最佳接种浓度的确立
• 3.3.3 不同代数的细胞生长能力的差异
• 3.4 讨论
• 第四章 锡类散对小鼠口腔成纤维细胞的影响
• 4.1 材料与试剂
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 主要试剂的配制
• 4.2.2 供试药物提取及配制
• 4.2.3 MTT比色法测细胞增殖情况
• 4.2.4 细胞群体倍增时间测定
• 4.2.5 羟脯氨酸比色法测细胞胶原蛋白合成能力
• 4.2.6 明胶酶谱分析
• 4.2.7 酶联免疫法（ELISA）测定上清液中TIMP-1的含量
• 4.2.8 锡类散提取物还原能力的测定
• 2O₂诱导的成纤维细胞损伤模型的建立'>4.2.9 H₂O₂诱导的成纤维细胞损伤模型的建立
• 4.2.10 超氧化物歧化酶（SOD）活性和脂质过氧化产物（MDA）的测定
• 4.2.11 一氧化氮（NO）的测定
• 4.2.12 统计学分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 锡类散促进成纤维细胞增殖
• 4.3.2 锡类散对成纤维细胞群体倍增时间的影响
• 4.3.3 锡类散促进成纤维细胞胶原合成
• 4.3.4 锡类散对基质金属蛋白酶活性-2，9的影响
• 4.3.5 锡类散促进组织基质金属蛋白酶抑制因子-1合成
• 4.3.6 锡类散提取物还原能力的测定
• 2O₂诱导的成纤维细胞损伤模型及锡类散处理前后的形态变化'>4.3.7 H₂O₂诱导的成纤维细胞损伤模型及锡类散处理前后的形态变化
• 4.3.8 锡类散提高过氧化氢损伤的成纤维细胞SOD酶活性
• 4.3.9 锡类散抑制过氧化氢损伤的成纤维细胞丙二醛的释放
• 4.3.10 锡类散促进过氧化氢损伤的成纤维细胞NO释放
• 4.4 讨论
• 第五章 锡类散单味药促愈合有效部位及作用机制研究
• 5.1 材料与试剂
• 5.1.1 仪器
• 5.1.2 药物及试剂
• 5.2 方法
• 5.2.1 主要试剂的配制
• 5.2.2 小鼠口腔成纤维细胞的原代培养
• 5.2.3 小鼠口腔成纤维细胞的传代培养
• 5.2.4 供试药物提取
• 5.2.5 细胞试验前各供试药物配制
• 5.2.6 细胞增殖试验
• 5.2.7 细胞群体倍增时间测定
• 5.2.8 细胞胶原合成试验
• 5.2.9 明胶酶谱试验
• 5.2.10 酶联免疫法（ELISA）测定TIMP-1试验
• 5.2.11 提取物还原能力的测定
• 5.2.12 SOD、MDA和NO的测定
• 5.3 结果
• 5.3.1 青黛提取物及靛玉红靛蓝对成纤维细胞的影响
• 5.3.2 人工牛黄对成纤维细胞的影响
• 5.3.3 合成冰片对成纤维细胞的影响
• 5.3.4 珍珠粉提取物及其不同部位对成纤维细胞的影响
• 5.3.5 象牙屑提取物对成纤维细胞的影响
• 5.3.6 人指甲提取物对成纤维细胞的影响
• 5.3.7 壁钱炭提取物对成纤维细胞的影响
• 第六章 全文主要结论、创新点及工作展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 创新点
• 6.3 今后的工作及展望
• 致谢
• 参考文献
• 学习期间发表的论文