SUMO-1修饰ataxin-3蛋白对其泛素化、降解、包涵体形成、细胞凋亡等的影响

SUMO-1修饰ataxin-3蛋白对其泛素化、降解、包涵体形成、细胞凋亡等的影响

论文摘要

背景:遗传性脊髓小脑型共济失调(hereditary spinocerebellar ataxia,SCAs)是一类常见的神经系统遗传病,分子遗传学研究已至少定位28种基因型,其中18个疾病基因已被克隆,脊髓小脑型共济失调3型/马查多-约瑟夫病(Spinocerebellar ataxia type 3/Machado-JoesphDisease,SCA3/MJD)为最常见亚型。其发病是由于致病基因MJD1编码区内3’端的CAG重复序列异常扩增导致其编码产物ataxin-3蛋白的羧基端多聚谷氨酰胺(polyglutamine,polyQ)肽链异常扩展引起。ataxin-3蛋白的生理功能尚不明确,其羧基端polyQ肽链异常扩展导致疾病发生的具体机制还不清楚。研究发现,蛋白质翻译后修饰在其生理功能的发挥及致病机制中具有重要的意义。小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)是新近发现的一类重要的蛋白质翻译后修饰因子。SUMO家族成员包括SUMO-1,SUMO-2,SUMO-3,SUMO-4等至少四个家族成员,它们主要功能是对底物蛋白进行苏素化(SUMOylation)修饰。与泛素化通路相似,SUMO-1修饰其底物包含一系列酶的级联反应。底物蛋白被SUMO-1修饰主要与底物蛋白的亚细胞定位、转录调控、蛋白质稳定性的调节等方面密切相关。泛素修饰底物蛋白主要导致底物蛋白被蛋白酶体降解,由于SUMO-1与泛素存在相同的靶蛋白结合位点—赖氨酸残基,苏素化与泛素化还具有拮抗作用,从而可能影响底物蛋白通过泛素蛋白酶体途径的降解。目前研究发现SUMO-1存在于阿尔茨海默病、多系统萎缩、多聚谷氨酰胺疾病(SCA1、SBMA、DRPLA、Huntingtin病)、帕金森病等多种神经退行性疾病的包涵体中。同时,很多与神经退行性疾病相关的蛋白被发现是SUMO-1的底物蛋白,苏素化可能参与了其生理及病理过程。在前期工作中,沈璐等应用酵母双杂交技术,以ataxin-3蛋白为Bait筛选成人脑cDNA文库,发现并证实ataxin-3蛋白以其氨基端与SUMO-1相互作用。汤建光等应用免疫荧光-激光共聚焦技术、免疫共沉淀技术,在真核细胞水平上进一步证实ataxin-3蛋白与SUMO-1存在相互作用,说明ataxin-3蛋白是SUMO-1的底物蛋白;并发现含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白经SUMO-1修饰后,可能使其细胞毒性加重,而RNAi下调SUMO-1的表达能缓解含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白的细胞毒性。廖书胜等应用在线SUMOplot分析程序(http://www.abgent.com.cn/doc/sumoplot/login.asp)分析,发现ataxin-3蛋白在第166位赖氨酸(K166)位点具有苏素化修饰模块位点(165VKD168),能被SUMO-1修饰;并应用Ni-NTA沉淀富集蛋白结合Western-blot技术证实SUMO-1修饰野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白的关键氨基酸位点为K166;免疫荧光实验初步证实SUMO-1修饰野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白并未改变其亚细胞定位。这些前期的研究工作结果:证实了ataxin-3蛋白是SUMO-1的底物蛋白,SUMO-1/苏素化参与了SCA3/MJD的发病过程。目的:从真核细胞水平探讨SUMO-1修饰对野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白的泛素化水平、降解情况、核内包涵体形成、细胞凋亡率的影响;进一步探讨SUMO-1修饰对野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白的胞浆/胞核分布的影响。方法:1.应用重组基因技术、Western-blot技术、GFP荧光技术构建并检测存在或缺失SUMO-1修饰位点的野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3的pEGFP-N1真核表达载体及其表达。2.应用亚细胞组分分离技术研究存在或缺失苏素化修饰的野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白胞浆/胞核分布的差异。3.应用免疫共沉淀技术分析过苏素化或缺失苏素化修饰位点的野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白泛素化水平的差异。4.应用追踪实验技术研究存在或缺失苏素化修饰位点的野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白降解水平的差异。5.应用荧光技术、PI/Annexin-V-FITC双染流式细胞仪技术分析存在或缺失苏素化修饰的野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白的核内包涵体形成及细胞凋亡率的差异。结果:1.DNA测序证实所构建的野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3的pEGFP-N1真核表达载体除了K166突变位点发生了改变、野生型ataxin-3其CAG三核苷酸重复次数为20次、polyQ异常扩展突变型CAG三核苷酸重复次数为68次外,其余位点均与ataxin-3在GenBank中的标准序列(S75313)完全匹配。核对各载体的阅读框在插入目的基因序列后均无移码,说明各真核表达载体构建成功。2.Western-blot证实野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3的pEGFP-N1真核表达载体均能在HEK 293T细胞中正常表达;荧光结果显示野生型ataxin-3及其K166R突变体在细胞中呈弥散分布,含polyQ异常扩展突变型ataxin-3及其K166R突变体能形成蛋白聚集物。3.亚细胞组分分离发现存在或缺失SUMO-1修饰位点对野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白的胞浆/胞核分布无明显影响。4.免疫共沉淀结果显示在外源性过表达SUMO-1或缺失SUMO-1修饰情况下,野生型与含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白的多聚泛素化水平可见明显差别,含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白的多聚泛素化水平更高;在外源性过表达SUMO-1或缺失SUMO-1修饰情况下,野生型ataxin-3蛋白的多聚泛素化水平无明显改变;同样,含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白的多聚泛素化水平也无明显改变。5.追踪实验发现野生型ataxin-3及其K166R突变体随时间延长蛋白逐渐降解,条带变化基本一致,未发现明显的差别;而含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白在第7小时、第15小时的条带均明显比含polyQ异常扩展突变型ataxin-3-68Q-K166R突变体同时间点的条带浓,说明含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白在存在SUMO-1修饰时变得更为稳定,降解明显减慢。6.随机双盲试验分析野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白核内包涵体有明显差异(P<0.005),说明polyQ的次数增加可导致核内包涵体的形成;在野生型组、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3组内比较时,有或无外源性过SUMO-1修饰、存在或缺失SUMO-1修饰位点时,核内包涵体的数目无明显差异。7.PI/Annexin V-FITC双染流式细胞仪结果显示:含polyQ异常扩展突变型ataxin-3组与其K166R突变体组比较,含polyQ异常扩展突变型ataxin-3组的早期凋亡率要高于含polyQ异常扩展突变型ataxin-3-K166R突变体组,存在显著性差别(P<0.005),说明SUMO-1修饰含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白对细胞有毒性作用,增加了细胞的凋亡率;野生型ataxin-3及其K166R突变体组间早期凋亡率未见明显差别(P>0.005),说明SUMO-1修饰野生型ataxin-3蛋白无明显细胞毒性作用。结论:1.构建成功野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3及其K166R突变体的pEGFP-N1真核表达载体。2.进一步证实SUMO-1修饰野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白不能改变其胞浆/胞核分布。3.证明SUMO-1修饰野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白的K166位点不是同时被泛素修饰。4.发现SUMO-1修饰含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白能延缓其降解。5.发现SUMO-1修饰含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白后增加了细胞毒性,但对核内包涵体形成无明显影响。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 英文缩略词
  • 前言
  • 第一节 存在或缺失SUMO-1修饰位点的野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3的pEGFP-N1真核表达载体的构建和表达检测
  • 1、材料与仪器
  • 2、实验方法
  • 3、结果
  • 4、分析与讨论
  • 附录
  • 第二节 SUMO-1修饰对野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白胞浆/胞核分布的影响
  • 1、仪器与材料
  • 2、实验方法
  • 3、结果
  • 4、分析与讨论
  • 第三节 SUMO-1修饰对野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白泛素化水平的影响
  • 1、材料与仪器
  • 2、实验方法
  • 3、结果
  • 4、分析与讨论
  • 第四节 SUMO-1修饰对野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白降解的影响
  • 1、材料与仪器
  • 2、实验方法
  • 3、结果
  • 4、分析与讨论
  • 第五节 SUMO-1修饰对野生型、含polyQ异常扩展突变型ataxin-3蛋白核内包涵体形成及细胞凋亡率的影响
  • 1、材料与仪器
  • 2、实验方法
  • 3、结果
  • 4、分析及讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 综述
  • 致谢
  • 攻读学位期间主要的研究成果
  • 相关论文文献

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