利用RNA干涉研究陆地棉体细胞胚胎发生高调表达基因的功能

论文摘要

RNA干涉（RNA interference, RNAi）技术,自1998年由Fire等人提出以来,由于其自身具有简单、高效、高通量等特点,越来越受到人们的重视,逐渐成为基因功能鉴定等生物技术领域的研究热点之一。随着其应用领域和应用技巧的不断拓展,各种研究新成果层出不穷。该技术已成功应用到棉花功能基因的研究当中,在棉花抗病、抗虫、抗逆以及纤维品质改良等诸多方面取得了可喜的研究结果。本研究基于本实验室构建的RNA干涉载体pCRI1210,利用本实验室构建的SSH （Suppression Subtractive Hybridization）文库,从中挑选有一定研究价值的ESTs,构建RNA干涉载体,研究它们对棉花组织培养过程中脱分化的影响。主要结果如下：1．利用叶盘转化法将载体pCRI1210-GUS转化烟草（NC89）,对本实验室构建的载体pCRI1210中的开放读码框（ORF, Open Reading Frame）部分进行验证：将载体中克隆自棉花的β-tubulin的内含子TUB intron用GUS基因替代,利用农杆菌介导的方法侵染烟草叶片,诱导出嫩芽、叶片和根后分别用GUS染液染色,用70%酒精脱色后,阳性组织均呈现明显的深蓝色,野生型组织变为白色,结果表明该表达框中的CaMV 35S启动子能够高效、稳定地启动外源基因的表达,报告基因能够被正常检测到,从而证明pCRI1210是一种多克隆位点选择范围广、启动效率高且易于检测的新型多功能干涉表达载体。2.利用干涉表达载体pCRI1210,构建针对抑制性消减杂交文库（SSH）中的四个ESTs的干涉载体,利用农杆菌介导的方法侵染棉花（中24）无菌苗的下胚轴切段,半定量RT-PCR结果显示,干涉后的愈伤组织中对应mRNA的含量有了不同程度的下降,统计学分析后发现出愈率和对照相比均有所改变。其中,干涉载体pCRI210-418对应的愈伤组织出愈率有所提高,而pCRI210-447、pCRI210-496和pCRI210-653对应的愈伤组织出愈率依次降低。同时,利用基因枪轰击法转化胚性愈伤组织,不同载体之间单位质量的组织中胚状体出现的数目产生了差异。因此确定这些ESTs对棉花愈伤组织和胚性愈伤组织都有一定程度的影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 棉花转基因工程研究现状
• 1.1.1 棉花抗虫基因工程
• 1.1.2 棉花抗除草剂基因工程
• 1.1.3 棉花抗病基因工程
• 1.1.4 其他棉花基因工程
• 1.2 棉花转基因常用方法
• 1.3 RNA干涉技术及其在棉花上的应用
• 1.3.1 RNA干涉技术简介
• 1.3.2 RNAi作用机制
• 1.3.3 RNAi在棉花中的研究与应用
• 1.3.4 RNAi在其他植物和农业中的应用
• 1.3.5 RNAi在棉花研究和应用中的展望
• 1.4 本研究的目的及其意义
• 1.5 实验技术路线
• 第二章 RNA干涉表达载体PCRI1210的验证
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 烟草材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 酶和生化试剂
• 2.1.4 试剂盒
• 2.1.5 引物合成和测序
• 2.1.6 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 种植烟草幼苗
• 2.2.2 干涉表达框表达效果检测载体pCRI11210-GUS的构建
• 2.2.3 LBA4404农杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.4 叶盘法转化烟草
• 2.2.5 转基因烟草的分子生物学和GFP检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 pCRI1210 TUB intron两侧多克隆位点酶切验证
• 2.3.2 pCRI1210和pBI121的双酶切
• 2.3.3 大肠杆菌转化子的菌落PCR检测
• 2.3.4 大肠杆菌转化子的酶切检测
• 2.3.5 pCRI1210-GUS和pBI121转化农杆菌
• 2.3.6 菌落PCR检测农杆菌pCRI1210-GUS和pBI121
• 2.3.7 叶盘法转化烟草
• 2.3.8 转基因烟草的分子生物学检测
• 2.3.9 转基因烟草生长状态
• 2.4 讨论
• 第三章 陆地棉体细胞胚胎发生相关ESTS功能验证
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 棉花材料
• 3.1.2 菌株和质粒
• 3.1.3 酶和生化试剂
• 3.1.4 试剂盒
• 3.1.5 引物合成和测序
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 各EST pMD19-T simple载体的构建
• 3.2.2 各EST干涉载体的构建
• 3.2.3 农杆菌介导转化棉花
• 3.2.4 半定量RT-PCR
• 3.2.5 基因枪轰击法转化棉花
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 各EST碱基序列及其功能比对
• 3.3.2 EST序列的获得和干涉载体的构建
• 3.3.3 农杆菌介导法转化棉花
• 3.3.4 愈伤组织的分子生物学检测
• 3.3.5 半定量RT-PCR
• 3.3.6 基因枪轰击法转化棉花
• 3.4 讨论
• 第四章 创新点
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历