青霉素酶基因异源表达及青霉素酶固定化研究

论文摘要

青霉素酶是B-内酰胺酶的一种,由于其具有水解青霉素类抗生素的B-内酰胺环的特点而得到广泛应用。但是国内该酶的产酶菌株Bacillus cereus CMCC（B） 63301存在着产酶能力较低、培养基价格昂贵和生产过程中酶活力不稳定等缺点。本论文以遗传背景较清楚的Bacillus cereusATCC10987为出发菌株,通过分子生物学手段重点研究了青霉素酶基因（penp）的克隆及分别在大肠杆菌与枯草芽孢杆菌中的高效表达,并对重组菌的发酵条件进行了优化,同时对经过纯化的青霉素酶的固定化进行研究。主要研究内容和结果如下：1.青霉素酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达以Bacillus cereus 10987总DNA为模板,通过PCR技术获得了青霉素酶成熟肽基因,构建克隆载体pUC-penp;构建表达载体pET28-penp,将其电转化到E.coli BL21（DE3）中,IPTG诱导后酶活力为227.8U/mL；通过单因素试验对重组菌诱导条件的优化,酶活力可达到480U／mL。2.青霉素酶的固定化及分解牛乳中残留青霉素的研究利用Ni2+亲合层析柱纯化了重组菌表达的目的蛋白,纯化后的目的蛋白纯度超过90%。确定了高碘酸钠氧化法制备载体的条件和固定化青霉素酶的条件,并利用该固定化酶将牛奶（含0.5U青霉素G/m1）中的青霉素分解到浓度小于4μg/L。另外,还对该固定化酶的操作稳定性和储藏稳定性进行了研究。3.青霉素酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达将青霉素酶基因克隆到pWB980中,即构建了分泌型表达载体pWB-penp,将其化学转化到Bacillus subtilis DB104中；重组菌在LB培养基中生长24小时,酶活力达到339U／mL。结合单因素实验和正交实验优化得到了重组菌产酶的最适培养基和最适发酵条件,优化后酶活力达到2564.5U/mL,比优化前提高了6.56倍。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 β-内酰胺类抗生素
• 1.2 β-内酰胺酶
• 1.2.1 β-内酰胺酶的定义及作用方式
• 1.2.2 β-内酰胺酶的分类
• 1.3 青霉素酶
• 1.3.1 产生青霉素酶的微生物
• 1.3.2 青霉素酶的理化性质
• 1.3.3 青霉素酶活性中心结构及催化机制
• 1.3.4 青霉素酶活测定方法
• 1.4 青霉素酶的分子生物学
• 1.5 青霉素酶的应用
• 1.5.1 在处理青霉素超标牛乳中的应用
• 1.5.2 在酶联免疫分析中的应用
• 1.5.3 在生物传感器中的应用
• 1.5.4 在前药研制中的应用
• 1.6 本论文研究的意义及内容
• 1.6.1 研究的意义
• 1.6.2 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒与菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要溶液
• 2.1.5 培养基和抗生素
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 紫外分光光度法测定青霉素酶活力
• 2.2.2 腊样芽孢杆菌ATCC10987总DNA的提取
• 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.4 质粒的小量提取
• 2.2.5 转化实验
• 2.2.6 目的基因扩增
• 2.2.7 连接反应
• 2.2.8 转化子鉴定实验
• 2.2.9 基因克隆及测序
• 2.2.10 大肠杆菌表达载体的构建
• 2.2.11 青霉素酶基因在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.2.12 重组蛋白浓度测定
• 2.2.13 青霉素酶的纯化
• 2.2.14 青霉素酶的固定化
• 2.2.15 碘量法测定固定化酶活力
• 2.2.16 氧化纤维素醛基含量的测定
• 2.2.17 微生物法测定青霉素含量
• 2.2.18 固定化青霉素酶的酶学性质研究
• 2.2.19 枯草芽孢杆菌表达载体的构建
• 2.2.20 青霉素酶基因在枯草芽孢杆菌的表达及发酵过程优化
• 3 结果与讨论
• 3.1 青霉素酶基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达
• 3.1.1 腊样芽孢杆菌染色体DNA的提取
• 3.1.2 PCR扩增目的基因
• 3.1.3 克隆质粒的构建及序列分析
• 3.1.4 pET28-penp原核表达载体的构建与鉴定
• 3.1.5 重组菌生长规律及质粒稳定性的研究
• 3.1.6 外源基因的诱导表达及发酵条件的优化
• 3.2 青霉素酶的固定化及去除牛奶中残留青霉素的研究
• 3.2.1 青霉素酶的纯化
• 3.2.2 固定化载体的选择及氧化条件的优化
• 3.2.3 青霉素酶的固定化及固定化条件的优化
• 3.2.4 固定化酶去除牛奶中残留的青霉素
• 3.2.5 固定化酶的稳定性研究
• 3.3 青霉素酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达
• 3.3.1 pWB-penp原核表达载体的构建与鉴定
• 3.3.2 酶切鉴定
• 3.3.3 PCR鉴定
• 3.3.4 重组菌B.subtilis/pWB-penp的表达及酶活力分析
• 3.3.5 种龄的确定及重组菌质粒稳定性的研究
• 3.3.6 培养基的优化
• 3.3.7 培养条件的优化
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间论文发表情况
• 8 致谢