稻瘟病菌中VPS29和VPS26基因的功能分析

论文摘要

稻瘟病是水稻生产上最重要的病害之一,分布遍及几乎世界各产稻区。现对该菌丝生长发育、产孢过程、附着胞形成以及侵染宿主等过程已有了一定程度上的了解,但对于这些过程中涉及到的细胞内物质运输仍需要进一步探索。Vps26与Vps29作为Retromer蛋白复合体cargo-selection亚基的组成原件,参与将其识别的蛋白从内含体逆向运输到高尔基体,进而完成各种生命活动。在稻瘟病菌中,对此两个基因进行敲除,结果发现△Vps26与△Vps29缺失突变体菌丝生长速度与野生型相比并无显著性差异,但VPS29与VPS26缺失突变体在含有外源细胞壁抑制剂刚果红、荧光增白剂、SDS时,突变体较野生型菌丝生长受抑制程度大。△Vps26和△Vps29缺失突变体产孢量仅为野生型1/3左右,但其分生孢子梗仍可正常形成,孢子形态和萌发与野生型无异,附着胞亦可正常发育形成。此外,缺失突变体仍具有侵染洋葱表皮细胞的能力,但其侵染率不到5%,相比于野生型40%的侵染效率,其侵染效率显著下降。麦离体接种及水稻喷雾接种实验证实,VPS26与VPS29基因敲除后其致病性显著下降。另外,上述生理缺陷,在获得的Vps26-2-com-49与Vps29-2-com-1互补菌中,均获得恢复。因此,VPS26与VPS29通过参与内含体逆向运输往高尔基体的过程,影响细胞物质循环,从未在维持稻瘟病菌的菌丝细胞壁完整性、调节产孢以及保持致病等多个生理过程发挥功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 稻瘟病菌概况
• 1.1 稻瘟病菌侵染
• 2 Retromer复合体
• 2.1 Retromer复合体组成
• 2.2 Retromer复合体功能
• 2.3 cargo-selective亚基功能
• 2.3.1 酵母中的Vps26与Vps29
• 2.3.2 植物中的Vps26与Vps29
• 2.3.3 动物中的Vps26与Vps29
• 3 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 抗生素
• 2.1.4 生化试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 生物信息学分析
• 2.2.2 引物设计与PCR扩增
• 2.2.3 DNA纯化回收
• 2.2.4 T-A克隆
• 2.2.5 稻瘟病菌目的基因敲除载体构建
• 2.2.6 稻瘟病菌原生质体制备
• 2.2.7 稻瘟病菌原生质体转化
• 2.2.8 转化子DNA粗提取
• 2.2.9 转化子PCR验证
• 2.2.10 突变体菌丝生长速度测定
• 2.2.11 突变体细胞壁敏感性鉴定
• 2.2.12 突变体产孢量计数与分生孢子形态观察
• 2.2.13 孢子萌发以及附着胞形成率观察
• 2.2.14 分生孢子对洋葱表皮侵染情况观察
• 2.2.15 大麦叶片离体接种实验
• 2.2.16 水稻活体致病性观察
• 2.2.17 含有绿色荧光蛋白互补载体构建
• 2.2.18 互补转化子获得与验证
• 2.2.19 绿色荧光光蛋白对目的基因的初定位
• 第三章 结果分析
• 3.1 VPS29结果及分析
• 3.1.1 VPS29生物信息分析
• 3.1.2 VPS29敲除突变体与荧光互补菌株的获得
• 3.1.3 VPS29突变后对生长速度测定
• 3.1.4 VPS29敲除突变体细胞壁完整性
• 3.1.5 VPS29敲除突变体稻瘟病菌产孢与分生孢子状态分析
• 3.1.8 Vps29突变体致病性分析
• 3.1.9 Vps29绿色荧光蛋白的亚细胞初定位
• 3.2 VPS26结果分析
• 3.2.1 Vps26生物信息分析
• 3.2.2 VPS26敲除突变体与荧光互补菌株的获得
• 3.2.3 VPS26敲除突变体生长速度测定
• 3.2.4 VPS26突变体细胞壁敏感性
• 3.2.5 VPS26敲除突变体产孢与分生孢子状态分析
• 3.2.8 VPS26敲除突变体致病性分析
• 3.2.9 Vps26绿色荧光蛋白的亚细胞初定位
• 第四章 小结与讨论
• 4.1 Vps26与Vps29进化上的保守
• 4.2 VPS26与VPS29对稻瘟病菌菌丝生长影响
• 4.3 VPS26与VPS29影响稻瘟病菌形成分生孢子
• 4.4 VPS26与VPS29与稻瘟病菌侵染能力关系密切
• 4.5 Vps26与Vps29在稻瘟病菌中亚细胞初步定位
• 4.6 稻瘟病菌Vps26与Vps29可能形成复合体发挥功能
• 参考文献
• 附录 本研究中所使用的引物
• 致谢