柞蚕HSP70基因的克隆和序列分析

论文摘要

热休克蛋白（heat shock protein）是在从细菌到哺乳动物中广泛存在一类热应急蛋白质。当有机体暴露于高温时，就会激发合成此种蛋白来保护有机体自身，发挥着重要的生物学功能。HSP70是热休克蛋白家族中最重要的一员,被称为主要热休克蛋白,由HSP70基因家族编码。目前热休克蛋白在果蝇、摇蚊、烟草夜蛾、美洲大蠊、飞蝗、蜜蜂、褐飞虱等昆虫中已得到了广泛研究，部分功能也已被证实。然而热休克蛋白70基因的结构及其功能尚不清楚。柞蚕（Antheraea pernyi），属鳞翅目大蚕蛾科昆虫，因喜食柞树叶得名，茧可缫丝，主要用于织造柞丝绸。基于探究柞蚕体内热休克蛋白70基因在柞蚕体内的分子作用机制，本实验采用RT-PCR方法首次克隆获得了柞蚕热休克蛋白70基因的基因序列（GenBank登录号：GU945199），该片段的序列长1905bp。生物信息学分析表明，该序列共编码634个氨基酸，预测蛋白的等电点和分子量大小分别为5.62和69.5kD，且柞蚕HSP70氨基酸序列具有昆虫HSP70的保守性结构特征。序列分析表明，柞蚕HSP70与与天蚕（Antheraea yamamai，AB179657.1）、家蚕（Bombyx mori）、甘蓝夜蛾（Mamestra brassicae）、棉铃虫（Heliothis viriplaca）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、烟草天蛾（Manducasexta）、膜翅目寄生蜂（Cotesiarubecula）、大鼠（Rattus norvegicus）、斑马鱼（Daniorerio）、果蝇（Drosophilamelanogaster）、人（Homo sapiens）HSP70等11个物种的HSP70基因核苷酸序列的同源性分别为95.7%、78.5%、76.1%、77.3%、76.6%、74.7%、65.9%、65.7%、66.7%、64.2%、45.2%；氨基酸序列同源性分别为98.11%、92.9%、90.8%、88.3%、91.3%、88.3%、72.7%、73.3%、72.3%、71.5、31.5%。可以看出：同属鳞翅目昆虫的柞蚕、天蚕、家蚕、甘草夜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾和烟草天蛾的HSP70基因的核苷酸序列的同源性在70%以上，氨基酸序列的同源性在80%以上。根据HSP70一级结构序列构建的系统进化树表明，柞蚕与天蚕、家蚕、烟草天蛾及甜菜夜蛾的亲缘关系较近。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 热休克蛋白
• 1.1.1 热休克蛋白的起源
• 1.1.2 热休克蛋白的特点
• 1.1.3 热休克蛋白的诱导机制
• 1.1.4 热休克蛋白的功能
• 1.1.4.1 HSP在热防御中的作用
• 1.1.4.2 分子伴侣
• 1.1.4.3 使生物获得耐热性
• 1.1.4.4 稳定细胞结构
• 1.1.5 热休克蛋白的基因结构及其表达
• 1.1.5.1 热休克基因
• 1.1.5.2 HSP的基因结构
• 1.1.5.3 HSP的基因表达
• 1.1.6 热休克蛋白与细胞增殖及细胞凋亡
• 1.1.6.1 细胞增殖
• 1.1.6.2 细胞凋亡
• 1.2 热休克蛋白70
• 1.2.1 概述
• 1.2.2 HSP70基因与蛋白质的结构特点
• 1.2.3 HSP70家族的生物学特性和分布
• 1.2.4 热休克蛋白70的主要功能
• 1.2.4.1 “分子伴侣”功能
• 1.2.4.2 HSP70与细胞的耐热性
• 1.2.4.3 HSP70---“细胞温度计”
• 1.2.4.4 促进细胞增殖
• 1.2.4.5 参与抗感染免疫
• 1.2.4.6 协助抗原的递呈加工
• 1.2.4.7 参与自身免疫性疾病的发生
• 1.2.4.8 抗细胞凋亡和坏死
• 1.2.4.9 细胞保护作用
• 2 引言
• 2.1 研究热休克蛋白（Hsps）的意义
• 2.1.1 Hsps与衰老的研究
• 2.1.2 Hsps与生物进化的研究
• 2.1.3 Hsps与生物标记（biomarker）
• 2.1.4 Hsps与肿瘤的治疗
• 2.2 主要研究内容
• 2.2.1 五龄柞蚕脂肪体RNA的提取
• 2.2.2 柞蚕热休克蛋白70基因序列的测定
• 2.3 技术路线
• 3 材料和方法
• 3.1 实验材料
• 3.2 仪器与试剂
• 3.2.1 主要实验仪器
• 3.2.2 主要生化试剂
• 3.2.3 常用溶液的配置
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 柞蚕脂肪体的提取
• 3.3.2 柞蚕脂肪体总RNA的提取
• 3.3.3 总RNA的检测
• 3.3.4 cDNA第一链的合成
• 3.3.5 RT-PCR反应成分及程序
• 3.3.6 RT-PCR反应产物的纯化
• 3.3.7 连接和转化
• 3.3.8 测序
• 3.3.9 序列拼接与分析
• 4 结果与分析
• 4.1 五龄柞蚕脂肪体总RNA的抽提
• 4.2 柞蚕HSP70基因cDNA序列的扩增
• 4.3 柞蚕HSP70基因序列分析
• 4.4 柞蚕HSP70基因cDNA序列及编码氨基酸同源性的比较
• 4.5 柞蚕HSP70基因ORF序列的系统进化分析
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介