DMN致肝损害小鼠模型肝组织基因表达谱变化及肝毒清对其干预作用的研究

论文摘要

由于肝脏功能的复杂性,肝损伤机理也呈现出复杂性；不同原因造成的肝损伤及具体机理不同。所以对于每种原因引起的肝损伤,都需要进行大量详尽的研究才可能阐明其机制。我们前期研究用DMN造成肝损伤模型,其病理损害特点实际上与重型肝炎一致。表现为肝组织大片出血坏死灶密集地遍布于肝组织,大部分出血坏死灶内肝细胞结构完全消失。本文中,我们研究了DMN诱导的肝损伤在病理损害较为严重的造模后48h时的肝组织基因表达谱变化,发现了该模型肝损伤中变化显著的基因；然后观察了中药复方肝毒清对这些变化显著的基因mRNA量的影响。1DMN诱导的小鼠肝损伤肝组织基因表达谱的变化昆明小鼠20只,体重18±2g,雄性。购买于广州中医药大学实验动物中心。随机取出10只小鼠作为空白对照组,腹腔注射生理盐水,10ml/kg；其余10只小鼠均腹腔注射DMN造模,造模剂量为15mgDMN/kg。至造模48h时分别取肝组织,每只小鼠取50mg,投入Trizol中,于-70℃冷冻保存。与上海康成生物科技有限公司联系好后送交该公司业务代表进行基因表达谱分析。实验结果显示,在小鼠44170个基因中,共发现有2331个基因表达的差异在2倍以上,其中1131个基因上调,1200个基因下调。而差异在6倍以上的基因有99个,其中53个上调,46个下调。这些6倍以上表达的基因涉及21个信号通路。其中有可能与肝组织损害相关的信号通路有12个,包括PPAR信号通路、脂肪酸代谢通路、p53信号通路、药物代谢通路、花生四烯酸代谢通路、甘油脂代谢通路、外源化学物质p450代谢通路、细胞外基质受体相互作用通路、TGF-β信号通路、细胞周期信号通路、MAPK信号通路。2DMN致小鼠肝损伤肝组织基因表达谱中显著改变的基因的验证昆明小鼠24只,体重18±2g,雄性。随机取出12只小鼠作为空白对照组,腹腔注射生理盐水,10ml/kg；其余12只小鼠均腹腔注射DMN造模,造模剂量为15mgDMN/kg。造模后48h处死所有小鼠,留取肝组织标本,进行定量PCR检测,主要验证前面分析到的可能与肝组织严重损害有关的信号通路中显著改变超过6倍以上的基因表达15个。在检测的15种mRNA中,所有RNA均定量PCR检测结果与基因表达谱检测结果基本一致。3中药复方对DMN诱导的小鼠肝损伤相关显著升高的mRNA表达的影响昆明小鼠60只,分为空白对照组、模型对照组、中药高剂量组（20g生药/kg.次）、中药中剂量组（10g/kg.次）、中药低剂量组（5g/kg.次）、联苯双酯组（150mg/kg.次）,模型组灌胃生理盐水100ml/kg.次。每组10只。除空白对照组外均腹腔注射DMN,15ul/kg,同时开始分组给药,每12h给药一次。48h后采集血清冻存于-70℃冰箱中,肝组织标本留取50mg左右投入含1mlTrizol的离心管中。本实验结果显示,复方肝毒清对DMN诱导的小鼠肝损伤升高的血清谷丙转氨酶具有明显的降低作用,这又一次显示了复方肝毒清具有确切的护肝作用；本实验结果还显示,在所检测的15个基因的mRNA中,复方肝毒清具有明显影响的有9个,它们分别是：CPT1C、CYP7A1、CDKN1A、THBS1、GSTA1、FMO3、MGLL、TGFB3、HSPB1。这些实验结果说明,肝毒清对DMN诱导的小鼠肝损伤肝组织的作用涉及多个肝损害相关的信号途径,但肝毒清仍然对一部分肝损害相关的基因mRNA未见明显影响。全文结论：1DMN诱导的小鼠肝损伤模型肝组织基因表达谱显示有2331个基因表达的差异在2倍以上,其中1131个基因上调,1200个基因下调。而差异在6倍以上的基因有99个,其中53个上调,46个下调。这些6倍以上差异表达的基因涉及21个信号通路。其中可能与肝损害关系密切的为涉及12个信号通路的15条基因。2复方肝毒清对所检测的15个基因的mRNA中的9个有显著影响,它们分别是：CPT1C、CYP7A1、CDKN1A、THBS1、GSTA1、FMO3、MGLL、TGFB3、HSPB1。显示了复方肝毒清改善DMN诱导的小鼠肝损害机制涉及多条信号通路的多条基因。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 文献研究
• 1 表达谱研究方法
• 1.1 表达谱技术
• 1.2 基因芯片核心技术
• 1.3 基因表达谱富集分析方法
• 2 重型肝炎的发生机制及中西医结合治疗
• 2.1 重型肝炎的发生机理
• 2.2 中医治疗FH的研究进展
• 2.3 肝性脑病的中西医治疗
• 2.4 肝肾综合征的中西医治疗
• 3 中医对重型肝炎的认识
• 3.1 病因病机
• 3.2 治疗方法
• 3.3 中医治疗重型肝炎的优缺点
• 第二部分 实验研究
• 1 DMN诱导的小鼠肝损伤肝组织基因表达谱的变化
• 1.1 材料和方法
• 1.2 实验结果
• 1.3 讨论
• 2 DMN致小鼠肝损伤肝组织基因表达谱中显著改变的基因的验证
• 2.1 材料和方法
• 2.2 实验结果（见表6）
• 2.3 讨论
• 3 中药复方对DMN诱导的小鼠肝损伤相关显著升高的mRNA表达的影响
• 3.1 材料和方法
• 3.2 实验结果
• 3.3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 附录:缩略词表
• 致谢