绵羊Oct4人工合成与Sox2克隆及逆转录病毒载体构建

论文摘要

诱导多能性干细胞的研究已成为当今医学和生物学等研究的热点领域,Oct4、Sox2、Klf4、Lin28和Nanog等多能性相关因子的研究也愈发重要。但迄今仍无通过绵羊诱导因子获得绵羊iPS细胞系的有关报道。本研究分别采用分子生物学和人工合成的方法,克隆获得绵羊Sox2基因编码区序列并合成了Oct4编码区序列,在对其进行序列分析的基础上,对其相关蛋白的特征进行了预测。在此基础上,建立了绵羊Sox2基因的逆转录病毒载体并获得病毒上清,将所获的病毒上清侵染绵羊成纤维细胞后,观察其侵染能力并对其进行转录水平的检测。该项研究为进一步完善绵羊iPS诱导方法奠定了基础。本研究主要结果和结论如下。（1）通过生物软件分析整理得到绵羊Oct4基因编码区1083bp的理论序列,并进行了人工合成。利用GenBank数据库资料和DNAMAN、DNAStar等生物软件,对绵羊Oct4基因编码区序列进行分析,结果表明其与牛的同源性达到97.8%,同时与猪、小鼠和大鼠等物种Oct4基因的同源性也较高；预测绵羊Oct4蛋白序列并对其进行分析,结果同样表明,其与牛的同源性高达98.3%,而与猪、小鼠和大鼠等物种Oct4蛋白同源性较高。而且绵羊Oct4蛋白含有细胞核定位模体和POU结构域。（2）利用胎绵羊肌肉组织DNA扩增并获得大小约为1000bp的绵羊Sox2基因特异条带,并经PCR和双酶切鉴定正确。对所获得的Sox2基因进行测序,其与GenBank中绵羊Sox2序列的相似性为100%。利用上述方法对克隆所获的绵羊Sox2基因编码区序列进行分析,结果表明其与牛的同源性达到99.5%,同时与猪、小鼠和大鼠等物种Sox2基因的同源性也较高；预测绵羊Sox2蛋白序列并对其采用相同方法进行分析,结果同样表明,其与牛的同源性高达100%,而与猪、小鼠和大鼠等物种Sox2蛋白同源性较高。而且绵羊Sox2蛋白含有细胞核定位模体和HMG结构域。（3）利用上述获得的Sox2基因与逆转录病毒载体pMXs连接,构建了逆转录病毒载体pMXs-Sox2,并经PCR、双酶切及测序鉴定正确。所获得的Sox2基因的病毒上清具有侵染感染能力,且其具有转录能力。综上所述,本研究成功获得绵羊Oct4和Sox2基因编码区序列,并成功构建了具有侵染能力的绵羊Sox2逆转录病毒载体pMXs-Sox2。为建立绵羊iPS细胞系进一步研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 体细胞重编程
• 1.2 iPS细胞的研究进展与应用
• 1.2.1 iPS细胞的研究进展
• 1.2.2 iPS细胞的诱导因子
• 1.2.3 诱导因子的表达载体
• 1.2.4 诱导体细胞重编程的机制
• 1.3 iPS细胞的应用前景
• 1.4 本研究的目的意义
• 2 绵羊Oct4的序列合成及分析
• 2.1 实验方法
• 2.1.1 绵羊Oct4编码区的序列合成
• 2.1.2 绵羊Oct4编码区的序列分析
• 2.1.3 绵羊Oct4蛋白生物信息学分析
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 绵羊Oct4编码区序列
• 2.2.2 绵羊Oct4基因生物学分析
• 2.2.3 绵羊Oct4蛋白生物学分析
• 2.3 讨论
• 2.4 本章小结
• 3 绵羊Sox2逆转录病毒载体的构建和序列分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验细胞及菌株
• 3.1.2 实验仪器设备
• 3.1.3 试剂来源
• 3.1.4 实验用药品的配制
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 胎绵羊基因组DNA的提取
• 3.2.2 绵羊Sox2引物设计及合成
• 3.2.3 绵羊Sox2诱导因子的扩增与回收
• 3.2.4 特异PCR片段与载体连接
• 3.2.5 质粒DNA的转化与提取
• 3.2.6 重组质粒的鉴定
• 3.2.7 绵羊Sox2基因编码区的序列分析
• 3.2.8 绵羊Sox2蛋白生物信息学分析
• 3.2.9 绵羊Sox2逆转录病毒载体的构建
• 3.2.10 绵羊Sox2假病毒颗粒的包装
• 3.2.11 绵羊Sox2逆转录假病毒的侵染及Sox2基因转录水平的检测
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 绵羊Sox2基因的PCR扩增
• 3.3.2 pMD18-T simple-Sox2重组质粒的鉴定
• 3.3.3 绵羊Sox2基因DNA测序结果
• 3.3.4 绵羊Sox2基因生物学分析
• 3.3.5 绵羊Sox2蛋白生物学分析
• 3.3.6 逆转录病毒载体重组质粒的鉴定
• 3.3.7 逆转录病毒载体的包装
• 3.3.8 逆转录假病毒侵染能力及Sox2基因转录水平的检测
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢