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基于人Survivin的重组蛋白与基因药物的研制及其促癌细胞凋亡的研究

2020-11-23阅读(872)

基于人Survivin的重组蛋白与基因药物的研制及其促癌细胞凋亡的研究

论文摘要

基于人Survivin的重组蛋白与基因药物的研制及其促癌细胞凋亡的研究 Survivin是1997年耶鲁大学Aitieric.DC等人在人类基因组库中首先筛选分离出来的IAP（凋亡抑制蛋白）家族的一个新成员，它表达于胚胎和发育的胎儿组织，而在成人分化的终末组织中不表达，但在人类大多数的肿瘤组织和转化细胞中大量表达。进一步研究表明Survivin在恶性肿瘤细胞的药物耐受和放化疗抗性及癌症复发中起着重要作用，具有促进肿瘤细胞增殖和抑制凋亡的双重作用。最新研究证实，癌细胞过度生长与凋亡受阻有直接的关系，并认为抑制Survivin是瓦解肿瘤生长的重要靶点。因此，国内外研究者认为，在肿瘤组织中特异性表达的Survivin是一个较为理想的肿瘤治疗新靶点，以其为靶点的新型抗癌药物设计已经成为国内外研究的热点。药物设计的核心是设计抑制Survivin发挥抗凋亡、促癌细胞生存的药物，由于Survivin定位于细胞内，因此目前国外在病毒介导的基因药物研究方面初步取得了较好抗癌效果。 本研究从人乳腺癌细胞系B-Cap37中成功克隆了编码Survivin蛋白的cDNA及其3个可变剪接体（其中一个为国际上首次报道），构建了4个干扰或抑制Survivin发挥抗凋亡作用的核酸治疗药物，并对他们进行了体外抑制癌细胞增殖的活性鉴定，通过基因工程大肠杆菌表达生产了1个含有转导肽HIV-TATm的Survivin突变体蛋白药物，并对其进行了离体癌细胞与荷瘤裸鼠体内促凋亡活性研究，主要获得了如下实验结果： 1．从人乳腺癌细胞系B-Cap-37中克隆鉴定出编码Survivin的cNDA及其3个剪接体Survivin-2B，Survivin-△EX3和Survivin-Image，其中Survivin-Image为国际上首次报道，已提交NCBI GenBank。经生物信息学软件对Survivin及各剪接体分别在核酸与蛋白水平进行序列分析与3D结构模拟，为这些基因应用于不同促凋亡药物的设计与构建奠定了基础。

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 英文缩略词
  • 第一章 文献综述
  • 第一节 Survivin研究进展
  • 1.Survivin基因与蛋白结构及其表达调控
  • 1.1 基因结构
  • 1.2 蛋白结构
  • 1.3 表达调控
  • 2.Survivin的生物学功能
  • 2.1 Survivin在细胞内的定位与磷酸化作用
  • 2.2 Survivin在正常组织中的表达及意义
  • 2.3 Survivin对肿瘤细胞的增殖和抗凋亡双重作用
  • 3.Survivin与其他基因、蛋白的关系
  • 3.1 Survivin与P53及Bcl-2的关系
  • 3.2 Survivin与Caspase的关系
  • 3.3 Survivin与cdk4的关系
  • cdc2的关系'>3.4 Survivin与p34cdc2的关系
  • 4.Survivin与血管生成
  • 5.Survivin 的表达与肿瘤
  • 5.1 Survivin在不同肿瘤组织中的表达
  • 5.2 Survivin在肿瘤组织中表达的临床意义
  • 6.Survivin与细胞凋亡
  • 6.1 细胞凋亡及其意义
  • 6.2 细胞凋亡途径与凋亡抑制家族
  • 6.3 Survivin对肿瘤细胞凋亡的抑制作用
  • 7.Survivin对肿瘤细胞周期的作用与机制
  • 7.1 Survivin对肿瘤细胞周期的调控
  • 7.2 Survivin对肿瘤细生长周期的调节机制
  • 8.Survivin表达与肿瘤预后
  • 9.Survivin表达与肿瘤治疗耐受性
  • 10.Survivin在肿瘤的诊断和治疗中的前景
  • 第二节 以Survivin为靶标的抗癌策略与TAT转导肽的意义
  • 1.Survivin作为抗癌靶的确认
  • 2.Survivin作为肿瘤靶标分子的优点
  • 3.靶向Survivin治疗肿瘤的前景
  • 4.靶向Survivin的药物设计策略
  • 4.1 反义寡核苷酸技术
  • 4.2 核酶靶Survivin治疗技术
  • 4.3 RNA干扰技术
  • 4.4 负显性突变体基因治疗
  • 4.4 细胞周期依赖性激酶抑制剂
  • 5.肿瘤基因治疗的现状与前景
  • 6.以Survivin为靶标的蛋白药物及其所面临的问题
  • 7.蛋白质转导域及其主要类型与特点
  • 7.1 蛋白质转导域及其主要类型
  • 7.2 蛋白质转导域的特点
  • 8.HIV-TAT及其PTD区段的结构与功能
  • 8.1 HIV-TAT转导域的发现
  • 8.2 TAT的基本结构
  • 8.3 TAT蛋白PTD的功能研究
  • 9.TAT蛋白PTD的作用机制研究
  • 10.TAT及其人工突变体在大分子药物转导中的应用前景
  • 11.本课题的研究目的及意义
  • 第二章 人源Survivin基因及其可变剪接体的克隆与生物信息学分析
  • 2.1 实验材料
  • 2.1.1 细胞与载体
  • 2.1.2 主要仪器设备
  • 2.1.3 主要试剂（盒）及培养基
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 细胞培养
  • 2.2.2 感受态细胞的制备、质粒的转化和提取
  • 2.2.3 引物设计
  • 2.2.4 Survivin总RNA提取
  • 2.2.5 Survivin基因的RT-PCR扩增
  • 2.2.6 PCR产物在pGEM-T vector上的克隆与鉴定
  • 2.2.7 Survivin及其剪接体的核酸序列测定
  • 2.2.8 Survivin及其剪接体的核酸与蛋白序列的生物信息学分析
  • 2.3 实验结果
  • 2.3.1 总RNA的提取与Survivin基因的扩增结果
  • 2.3.2 Survivin及其剪接体基因的T载体克隆与鉴定结果
  • 2.3.3 Survivin及其剪接体的测序结果分析
  • 2.3.4 Survivin及其剪接体基因结构组成分析结果
  • 2.3.5 Survivin及其剪接体编码的氨基酸的比对分析结果
  • 2.3.6 Survivin及其剪接体蛋白的3D结构模拟与分析结果
  • 2.4 讨论
  • 2.4.1 人乳腺癌细胞系中Survivin及其剪接体的克隆与用途
  • 2.4.2 Survivin新剪接体的克隆与意义
  • 2.4.3 Survivin及其剪接体的生物信息学分析意义
  • 2.5 小结
  • 第三章 基于Survivin的基因药物设计、制备与促癌细胞凋亡研究
  • 3.1 实验材料
  • 3.1.1 细胞与载体
  • 3.1.2 主要试剂与培养基
  • 3.1.3 主要仪器设备
  • 3.1.4 引物的设计与合成
  • 3.2 实验方法
  • 3.2.1 感受态细胞的制备、质粒的转化和提取
  • 3.2.2 survivin基因的PCR定点突变与序列测定
  • 3.2.3 EGFP基因的PCR扩增与序列测定
  • 3.2.4 Survivin及其剪接体不同真核表达载体的构建与鉴定
  • 3.2.5 基因治疗载体对人乳腺癌细胞B-Cap-37的转染及转染效果分析
  • 3.2.6 不同基因药物对癌细胞的促凋亡效果检测
  • 3.3 实验结果
  • 3.3.1 Survivin基因的PCR定点突变结果
  • 3.3.2 EGFP基因扩增与测序结果
  • 3.3.3 Survivin及其剪接体不同真核表达载体的构建结果
  • 3.3.4 基因治疗载体转染人乳腺癌细胞后的荧光检测结果
  • 3.3.5 基因治疗载体转染人乳腺癌细胞后的MTT检测结果及凋亡效果评价
  • 3.4 讨论
  • 3.4.1 Survivin负显性突变体与定点突变技术
  • 3.4.2 以survivin及其剪接体为基础构建促凋亡基因药物的策略与方法
  • 3.4.3 细胞转染技术及转染试剂的选择
  • 3.4.4 以survivin及其剪接体为基础的基因治疗的效果与意义
  • 3.5 小结
  • 第四章 重组蛋白TATm-Survivin（T34A）的基因构建、高效表达与纯化鉴定
  • 4.1 实验材料
  • 4.1.1 菌株和质粒
  • 4.1.2 主要试剂及培养基
  • 4.1.3 主要仪器
  • 4.2 实验方法
  • 4.2.1 质粒提取与转化
  • 4.2.2 Survivin基因的定点突变
  • 4.2.3 TAT蛋白转导结构域的构建
  • 4.2.4 重组表达质粒的构建与鉴定
  • 4.2.5 重组蛋白的核苷酸序列分析
  • 4.2.6 重组蛋白的诱导表达
  • 4.2.7 表达蛋白含量的测定
  • 4.2.8 不同诱导条件对TATm-Survivin（T34A）基因表达的影响
  • 4.2.9 目的蛋白的免疫印迹鉴定
  • 4.2.10 目的蛋白的纯化
  • 4.3 实验结果
  • 4.3.1 重组表达质粒pRSET-B-TATm-Survivin（T34A）的构建与鉴定结果
  • 4.3.2 重组表达载体的核苷酸测序结果分析
  • 4.3.3 表达产物的SDS-PAGE分析
  • 4.3.4 目的蛋白的表达方式鉴定
  • 4.3.5 不同诱导条件对TATm-Survivin（T34A）基因表达的影响
  • 4.3.6 重组蛋白的免疫印记实验结果
  • 4.3.7 目的蛋白的分批发酵培养表达结果
  • 4.3.8 表达产物TATm-Survivin（T34A）纯化和复性结果
  • 4.4 讨论
  • 4.4.1 以Survivin为肿瘤治疗靶点药物的设计与重组蛋白药物设计的意义
  • 4.4.2 基因工程大肠杆菌高效发酵生产TATm-Survivin的影响因素
  • 4.4.3 以包涵体形式表达TATm-Survivin的分离纯化与优缺点
  • 4.5 小结
  • 第五章 重组蛋白TATm-Survivin（T34A）在体内外促癌细胞凋亡研究
  • 5.1 实验材料
  • 5.1.1 细胞株和实验动物
  • 5.1.2 主要试剂及其配置
  • 5.1.3 主要仪器设备
  • 5.2 实验方法
  • 5.2.1 细胞培养方法
  • 5.2.2 药物的配制与贮存
  • 5.2.3 TATm-Survivin（T34A）体外促细胞凋亡作用
  • 5.2.4 人乳腺癌B-Cap-37细胞裸小鼠移植瘤模型的建立
  • 5.2.5 体内试验药物的内毒素与溶血性检测
  • 5.2.6 TATm-Survivin（T34A）动物体内活性检测与评价
  • 5.3 实验结果
  • 5.3.1 光镜下观察药物蛋白对细胞的影响
  • 5.3.2 MTT法检测TATm-Survivin（T34A）对癌细胞生长的抑制作用
  • 5.3.3 流式细胞技术检测TATm-Survivin（T34A）处理后的细胞周期改变
  • 5.3.4 萤光染色法检测凋亡结果
  • 5.3.5 蛋白药物对癌细胞集落形成的影响
  • 5.3.6 药物的溶血性实验结果
  • 5.3.7 人乳腺癌细胞B-Cap-37细胞的BALB／cA-nu小鼠模型的建立
  • 5.3.8 药物处理对BALB／cA-nu裸鼠的体重及行为表现的影响
  • 5.3.9 在体内TATm-survivin（T34A）对BALB／cA-nu裸鼠肿瘤形成的影响
  • 5.4 讨论
  • 5.4.1 重组蛋白药物对离体癌细胞促凋亡活性检测方法分析
  • 5.4.2 实体瘤动物模型的建立及其作用
  • 5.4.3 重组蛋白TATm-Survivin（T34A）对动物的安全性与毒性
  • 5.4.4 重组蛋白TATm-survivin（T34A）对荷瘤小鼠的作用与意义
  • 5.5 小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 发表文章

    • 相关论文文献

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