固相合成活性肽工艺优化及活性验证

论文摘要

固相合成多肽（SPPS）技术是将要合成肽链的C端氨基酸先连接在固相载体上，通过N末端逐个加氨基酸的方法。自从1963年著名生化学家Merrifield发表了第一篇以固相树脂为载体合成四肽的文章后，经过近50年的发展与完善，固相合成多肽技术由于其方便快速、可自动化的优点，成为了多肽合成中的一种首选方法。而如何降低固相合成中试剂毒性、副产物干扰，提高多肽合成的效率和产率，以及降低昂贵的费用等问题一直都是固相合成研究中的重要方向。本研究课题中合成的VR-6、LS-7序列是运用生物信息学方法筛选出来的生物活性多肽（序列由导师提供，因申请专利保护，不便公开）。通过生物信息学方法预测，VR-6、LS-7对癌细胞有抑制作用。树脂与首个氨基酸的连接率决定着目标肽链的得率。本研究课题针对固相合成中关键原料：树脂、氨基酸、DCC（N’N-二环己基碳二亚胺）、HOBt（N-羟基苯并三氮唑）、DMAP（二甲基氨基吡啶）的用量，将这些原料分组成3个因素，设计正交试验获得首个氨基酸与树脂最优连接率时的配比。正交设计以树脂固定为1eq（0.2mmol，一个计量单位），氨基酸与DCC为因素一，HOBt为因素二，DMAP为因素三，每个因素做三个水平（因素一、二的水平取2eq、3eq、4eq，因素三的水平取0.3eq、0.4eq、0.5eq）。最后对正交数据分析，得到连接率最优配比，并对各个配比进行成本核算，比较得出最优的工艺条件。最后运用获得的最优工艺条件指导实践中活性多肽（VR-6、LS-7）的合成，并验证合其活性。以合成VR-6为例，最终结果表明，与常用的高得率（74.58%）方法相比，按照本研究课题的优化工艺合成的得率（80.58%）提高了整整五个百分点，且大幅降低了合成的成本。利用MTT法对合成多肽的活性进行细胞试验，结果表明，VR-6、LS-7对肝癌细胞HepG2和胃癌细胞SGC7901有明显的抑制作用。VR-6对肝癌细胞与胃癌细胞的最高抑制率浓度均为10μmol；LS-7对肝癌细胞与胃癌细胞的最高抑制率浓度也为10μmol。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 活性肽的简述
• 1.1.1 定义及分类
• 1.1.2 活性肽的结构特点
• 1.1.3 活性肽的研究进展
• 1.2 多肽合成的原理和基本方法
• 1.2.1 多肽液相合成
• 1.2.2 多肽固相合成
• 1.3 固相合成活性肽
• 1.3.1 固相合成多肽步骤
• 1.3.1.1 固相合成的要求
• 1.3.1.2 固相合成的基本过程
• 1.3.1.3 氨基酸的保护策略
• 1.3.1.4 载体树脂
• 1.3.1.5 肽键缩合试剂
• 1.3.2 固相合成多肽的检测、纯化与分析
• 1.3.2.1 固相合成多肽检测
• 1.3.2.2 多肽的分离纯化
• 1.3.2.3 多肽分析
• 1.4 本课题研究的意义和主要内容
• 1.4.1 研究意义
• 1.4.2 研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验仪器设备、材料及试剂
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 实验材料
• 2.1.2.1 固相合成活性肽所用材料
• 2.1.2.2 生物活性验证原材料
• 2.1.3 固相合成使用试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 固相合成活性肽装置与流程
• 2.2.1.1 固相合成活性肽实验装置
• 2.2.1.2 正交设计实验装置
• 2.2.1.3 反应流程图
• 2.2.2 固相合成活性肽步骤
• 2.2.2.1 氨基酸与 Wang-Resin 的连接
• 2.2.2.2 Fmoc 吸光法测定第一步连接率
• 2.2.2.3 氨基酸保护基的脱除
• 2.2.2.4 DCC/HOBt 法缩合剩余氨基酸
• 2.2.2.5 树脂-氨基酸复合物的切割
• 2.2.2.6 粗纯活性肽的反向 RP-HPLC 监测分析
• 2.2.3 正交试验工艺优化
• 2.2.4 合成多肽活性验证
• 2.2.4.1 HepG2、SGC7901 细胞株传代
• 2.2.4.2 细胞计数法
• 2.2.4.3 接种 96 孔板，MTT 活性验证
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 树脂和首个氨基酸连接率优化
• 3.1.1 Fmoc 吸光法分析
• 3.1.1.1 Fmoc 吸光法标准曲线的建立
• 3.1.1.2 氨基酸-树脂连接率正交试验表
• 3.1.1.3 正交优化结果分析
• 3.2 优化工艺方法合成活性肽
• 3.2.1 优化工艺指导合成 VR-6、LS-7
• 3.2.1.1 优化工艺合成 VR-644
• 3.2.1.2 优化工艺合成 LS-745
• 3.2.2 合成活性肽的分析
• 3.2.2.1 未优化前合成 VR-6、LS-7 分析
• 3.2.3 液质联用分析合成多肽
• 3.3 固相合成多肽的活性验证
• 3.3.1 MTT 法检测细胞凋亡
• 3.3.2 活性肽对肝癌 HepG2 和胃癌 SGC7901 细胞抑制作用
• 3.3.2.1 LS-7 和 VR-6 对胃癌 SGC7901 细胞抑制作用
• 3.3.2.2 LS-7 和 VR-6 对肝癌 HepG2 细胞抑制作用
• 结论与展望
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 研究成果