农杆菌介导的NPK1基因转化辣椒的研究

论文摘要

辣椒（Capsicum annuum L.）是一种很重要的蔬菜作物,既可直接生食,也可以作为调味品,具有丰富的营养价值和经济价值,广泛栽培于世界各地。但由于恶劣的自然环境的影响和近年来病虫害的频繁发生,大大降低了辣椒的产量和品质。因此,关于如何提高辣椒的抗逆、抗病性的研究工作已成为重要的科技课题。随着分子生物学的不断深入,辣椒育种工作的方式方法也逐渐变得更加多样和成熟。烟草的NPK1基因是参与细胞周期调控的MAPKKK激酶,在植物的生长发育调节和抗逆等生理过程中起重要作用。本试验试图通过农杆菌介导的遗传转化方法把NPK1基因导入辣椒中,旨在建立和优化农杆菌介导辣椒遗传转化技术,为研究辣椒基因功能奠定基础。以9个辣椒（Capsicum annuum L.）品种为材料,对辣椒高频再生体系的建立进行了系统研究与比较分析。并以其中3个再生能力好的品种为试材,对影响农杆菌转化的诸因素、再生植株筛选与鉴定方面进行了较为系统的研究分析。在此基础上,以辣椒子叶为外植体,通过农杆菌介导的遗传转化方法将NPK1基因导入辣椒,获得转基因再生植株。其主要结果如下:1.不同辣椒品种的再生能力差别较大,其中以品种B17、P41和P54的分化能力最强;辣椒植株离体再生体系中,较高的6-BA/IAA值有利于辣椒外植体的分化再生,而6-BA/IAA值较低则适合于再生芽的伸长;辣椒子叶和带柄子叶的再生能力比下胚轴强,是较好的外植体材料;不同苗龄的子叶再生能力也有差异,以12-16d苗龄的外植体为好;高频率的不定芽分化培养基为MS无机成分+B5有机成分+0.5mg/L IAA +5.0mg/L 6-BA;不定芽伸长的适宜培养基为MS无机成分+B5有机成分+ 0.5mg/L IAA + 1.5mg/L 6-BA + 2.0mg/L GA3;高效生根诱导培养基为MS无机成分+B5有机成分+0.2mg/L IAA + 0.1mg/L NAA。2.农杆菌介导辣椒遗传转化的适宜条件是:切取14d苗龄子叶外植体,在MS无机盐成分+B5有机成分+0.5mg/L IAA+5.0mg/L 6-BA的琼脂培养基上预培养2d后,浸没于农杆菌菌液中侵染8-10min,共培养于MS无机盐成分+B5有机成分+0.5mg/L IAA +5.0mg/L 6-BA上2d后,转移至延迟培养基MB+0.5mg/L IAA +5.0mg/L 6-BA +250mg/L Cef延迟选择2d,随后转移至MB+0.5mg/L IAA+5.0mg/L 6-BA +250mg/L Cef+50mg/L Km进行选择培养。3.试验共获得抗性植株48株,PCR检测获得阳性植株17株,RT-PCR检测获得转基因植株14株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 辣椒基因工程研究进展
• 1.1.1 辣椒的离体再生
• 1.1.2 辣椒遗传转化研究进展
• 1.1.2.1 抗病毒病
• 1.1.2.2 抗真菌病
• 1.1.2.3 抗细菌病
• 1.1.2.4 抗除草剂
• 1.1.2.5 抗虫基因工程
• 1.1.3 辣椒基因工程中存在的主要问题
• 1.1.3.1 辣椒植株再生
• 1.1.3.2 遗传转化率低
• 1.1.3.3 转化方法单一
• 1.2 植物抗病基因工程
• 1.2.1 基因对基因假说
• 1.2.2 系统性抗性
• 1.2.2.1 系统获得性抗性Systemic Acquired Resistance, SAR)
• 1.2.2.2 诱导性系统抗性（Inducing System Resistance, ISR）
• 1.2.2.3 植物抗病信号传导途径及其相互作用
• 1.3 植物抗逆基因工程研究
• 1.3.1 渗透保护物质（Osmoprotectant） 生物合成的关键酶基因
• 1.3.2 脯氨酸生物合成的相关基因
• 1.3.3 糖类物质生物合成的相关基因
• 1.3.4 多元醇生物合成相关基因
• 1.3.5 多胺（Polyamine）
• 1.3.6 胚胎后期发生富集蛋白基因
• 1.3.7 编码转录因子的调节基因
• 1.3.8 抗氧化和毒性降解酶相关基因
• 1.3.9 MAPK 研究进展
• 1.4 研究的目的及意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基与溶液
• 2.2 方法
• 2.2.1 辣椒再生体系的建立
• 2.2.1.1 无菌苗的制备
• 2.2.1.2 不定芽的诱导和分化
• 2.2.1.3 不定芽的伸长
• 2.2.1.4 生根与移栽
• 2.2.2 烟草NPK1 基因的克隆
• 2.2.2.1 烟草DNA 的提取
• 2.2.2.2 聚合酶链式反应
• 2.2.2.3 DNA 序列分析
• 2.2.3 载体构建
• 2.2.3.1 玻璃粉法回收DNA 片段
• 2.2.3.2 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.3.3 质粒DNA 的提取
• 2.2.3.4 冻融法将中间载体导入农杆菌
• 2.2.4 NPK1 基因导入辣椒
• 2.2.4.1 外植体Km 抗性测定
• 2.2.4.2 农杆菌转染
• 2.2.4.3 转化植株的再生
• 2.2.4.4 植株的PCR 和PT-PCR 的检测
• 第三章 结果与分析
• 3.1 辣椒再生体系的建立
• 3.1.1 不定芽的诱导及分化
• 3.1.1.1 辣椒不同基因型对不定芽诱导分化的影响
• 3.1.1.2 不同激素及配比对辣椒不定芽诱导与分化的影响
• 3.1.1.3 不同外植体对不定芽诱导与分化的影响
• 3.1.2 不定芽的伸长
• 3.1.3 生根及移栽成苗
• 3.2 NPK1 基因的克隆及表达载体的构建
• 3.3 NPK1 基因转化辣椒
• 3.3.1 外植体Km 抗性测定
• 3.3.2 农杆菌的转染
• 3.3.3 预培养与侵染时间
• 3.3.4 转基因植株的PCR 和PT-PCR 的检测
• 第四章 讨论
• 4.1 辣椒再生体系的建立
• 4.1.1 激素和有机成分的使用
• 4.1.2 基因型、外植体类型及苗龄的影响
• 3 的影响'>4.1.3 AgNO₃的影响
• 4.2 NPK1 基因的克隆及表达载体的构建
• 4.2.1 烟草NPK1 基因
• 4.3 NPK1 基因转化辣椒
• 4.3.1 外植体Km 抗性测定
• 4.3.2 辣椒转NPK1 基因植株的获得
• 4.4 存在的问题及下一步工作
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 致谢
• 作者简介