猪MX1基因在气道上皮细胞SIV感染过程中的表达

论文摘要

Mx1基因是1964年在A2G小鼠上发现的抗流感病毒感染的基因。干扰素诱导产生的Mx蛋白具有广谱的抗病毒效应，使先天性主动免疫过程中起重要作用的蛋白因子之一。在流感病毒感染的过程中，它可以结合到流感蛋白的NP蛋白上，阻止病毒的增殖，因此具有抗流感病毒功能。猪Mx1基因已确定为猪抗病育种的候选基因。猪流感是对养猪业危害极大的一种传染病，病原为猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）。流感病毒存在于病猪和带毒猪的呼吸道分泌物中。我国猪养殖集约化程度低，即使猪患有流感，也没有引起大规模的爆发，因此我国的主要的商品猪对流感的抗性普遍比较弱，随着集约化饲养的发展，存在猪流感爆发的可能性，一旦爆发就会造成重大损失。因此抗病育种十分重要。本研究培养了SIV能特异性感染的猪气道上皮细胞，建立了干扰素诱导Mx1基因表达的体系，应用实时荧光定量PCR的方法检测Mx1基因的表达情况，探索了最佳诱导时间和诱导浓度。并对细胞在SIV感染早期Mx1基因的表达情况进行了研究。结论如下：（1）猪气道上皮细胞培养体系为DMEM／F12培养基+10％血清+1％双抗。所得细胞能够使SIV在其中增殖。（2） Mx1基因在细胞中的表达随干扰素诱导浓度的增加而增加，最适宜浓度为1000IU／mL。（3） Mx1基因在细胞中的表达不随干扰素诱导时间增加而增加，而是在4h左右达到最高。随后逐渐下降（4） Mx1基因在SIV早期感染中的表达不随时间的增加而增加而是在4-6小时达到最高，随后逐渐下降。其表达趋势与干扰素诱导的表达趋势大致相同。并且其表达趋势与人相近，可能说明猪与人的抗病能力存在某些相似情况，猪与人可能会感染相同的疾病。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 猪的抗病育种
• 1.1.1 猪的育种趋势
• 1.1.2 抗病育种
• 1.1.3 抗病育种面临的困难与前景展望
• 1.2 猪流感病毒研究进展
• 1.2.1 SIV的生物学特性
• 1.2.2 SIV分子生物学特性
• 1.3 抗病性状相关基因
• 1.3.1 NRAMP1基因
• 1.3.2 干扰素基因
• 1.3.3 MHC（主要组织相容性复合体）
• 1.3.4 ETEC K88受体基因
• 1.3.5 其他基因
• 1.4 拟研究的基因MX1基因
• 1.4.1 MX1的发现
• 1.4.2 MX1结构与功能
• 1.4.3 Mx1的应用与前景
• 1.5 实时荧光定量PCR
• 1.6 本研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.1.3 克隆载体和菌株
• 2.1.4 主要药品
• 2.1.5 主要试剂配置
• 2.1.6 主要生物学软件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 气道上皮细胞的体外培养
• 2.2.2 间接免疫荧光法鉴定细胞感染情况
• 2.2.3 细胞攻毒条件的确定
• 2.2.4 细胞攻毒
• 2.2.5 细胞总RNA的提取与质量检测
• 2.2.6 定性与定量检测
• 3 结果与分析
• 3.1 气道上皮细胞培养体系的建立
• 3.1.1 细胞的分离与培养
• 3.1.2 传代培养
• 3.1.3 生长曲线
• 3.2 细胞感染后间接免疫荧光检测
• 3.3 细胞 RNA的提取与质量检测
• 3.4 Mx1的扩增与鉴定
• 3.5 细胞攻毒后表达检测
• 3.5.1 标准曲线的制作
• 3.5.2 干扰素最佳诱导浓度的结果
• 3.5.3 干扰素最佳诱导时间的结果
• 3.5.4 SIV感染过程中的Mx1表达情况
• 4 讨论
• 4.1 气道上皮细胞的体外培养
• 4.1.1 取材
• 4.1.2 消化方法
• 4.1.3 培养液
• 4.2 感染后细胞免疫荧光检测
• 4.3 实时荧光定量 PCR检测
• 4.3.1 引物设计
• 4.3.2 实验操作注意事项
• 4.3.3 荧光检测条件的优化
• 4.4 Mx1诱导与表达情况
• 4.4.1 干扰素诱导浓度对Mx1表达的影响
• 4.4.2 干扰素诱导时间对Mx1表达的影响
• 4.4.3 SIV感染过程中的Mx1表达情况
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 硕士期间发表的文章