四川地区伞滑刃属线虫种类鉴定及其致病性研究

论文摘要

伞滑刃属线虫(Bursaphelenchus spp.)尤其是松材线虫(busaphelenchusxylophilius)是重要的森林病原线虫。该病具有寄主范围广,发病速度快,传播途径多和防治难度大等特点,被称为松树上的癌症。在防治和检疫工作中都需要对该类线虫进行准确和快速的鉴定,但在日常检验工作中还常常查获同属于伞滑刃属(Bursaphelenchus spp.)的多种与之形态非常相似的线虫,给鉴定工作带来一定的难度。本研究以四川地区枯死松木查获的伞滑刃属线虫为研究材料,通过形态学测定、PCR—RFLP及ITS区序列测定等方法对查获线虫进行了鉴定,并且对其治病性进行初步研究,主要研究结果如下:(1)对病死松木中所获伞滑刃属线虫分离纯培养后,通过显微测量及deman公式计算所获线虫的V、A、b等相关部位数值,并对其形态特征进行描述。结果显示在样本中共分离到六种伞滑刃属线虫,分别为松材线虫(Busaphelenchusxylophilius(Steiner & Buhrer,1934)Nickle,1970),拟松材线虫(B.mucronatusMamiya,1979)、莱鲁尔夫线虫(B.rainulfi Braassch,2002)、变异伞滑刃线虫(B.aberrans)、霍夫曼伞滑刃线虫(B.hofumanni);泰国伞滑刃线虫(B.thailandae)。(2)在ITS—RFLP(Restriction fragment length polymorphisim)研究中,采用单条线虫基因组DNA的提取方法,以确保基因组DNA的纯度,并以伞滑刃属线虫ITS区通用引物P1:5’—CGTAACAAGGTAGCTGTAG—3’,P2:5’—TTTCACTCGCCGTTACTAAGG—3’分别对分离得到的线虫进行PCR扩增,PCR扩增结果显示,所获线虫均得到约900bp左右的扩增片段,再利用AluⅠ、HhaⅠ、SalⅠ、DraⅠ四种限制性内切酶分别对PCR扩增产物进行酶切鉴定。结果表明,四种内切酶除SalⅠ外都能区分松材线虫和拟松材线虫,AluⅠ、HhaⅠ、DraⅠ三种内切酶还能同时区分其它四种伞滑刃属线虫。此外通过对松材线虫和拟松材线虫种群rDNA中ITS1、5.8S、ITS2区进行PCR扩增,产物经克隆并测序,然后进行序列分析及同源性比对,结果鉴定出YA、LS两个线虫种群为松材线虫;DZ、SN、LX三个地方的线虫种群为拟松材线虫,这也与前部分形态鉴定相符合。(3)在对所获伞滑刃属线虫的致病性研究中,所用接种树种为3～4年生的马尾松苗(Pinusm assoniana),接种量为3000头/株,接种一月后每周观察一次,结果显示YA和LS的种群(松材线虫Barsaphelenchusx ylophilus)能使马尾松致病,症状为:接种点至稍1/2长的一段的针叶褐变,且针叶褐变长度小于针叶全长的1/2,发病级别为Ⅱ级。接种其它四个种群及对照的马尾松均未见枯萎现象。分析原因可能为其它伞滑刃属线虫无致病性或致病性微弱而没有表现出致病性,也可能和接种马尾松的松龄以及四川雅安气候潮湿,年日照量偏低等原因有关,而使其它群体发病缓慢。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 前言
• 1 文献综述
• 1.1 松材线虫病的起源及其分布与危害
• 1.2 伞滑刃属线虫研究现状
• 1.3 伞滑刃属线虫形态学鉴定
• 1.4 生物化学和免疫学鉴定方法
• 1.4.1 蛋白质电泳分析
• 1.4.2 同工酶电泳技术
• 1.4.3 免疫学方法
• 1.4.4 分子生物学鉴定方法
• 1.5 伞滑刃属松材线虫致病性研究
• 2 材料和方法
• 2.1 伞滑刃属线虫分离、纯化及形态鉴定
• 2.1.1 样本来源
• 2.1.2 线虫分离、培养
• 2.1.3 线虫的鉴定
• 2.2 伞滑刃属线虫ITS区PCR扩增及RFLP分析
• 2.2.1 主要仪器及试剂
• 2.2.2 供试材料
• 2.2.3 线虫分离、培养
• 2.2.4 DNA的提取
• 2.2.5 ITS—PCR扩增
• 2.2.6 电泳检测PCR目的产物的质量
• 2.2.7 PCR产物酶切
• 2.3 线虫克隆及序列分析
• 2.3.1 供试材料
• 2.3.2 线虫分离、培养
• 2.3.3 DNA的提取
• 2.3.4 PCR扩增
• 2.3.5 电泳检测PCR目的产物的质量
• 2.3.6 PCR产物的克隆及测序
• 2.3.7 序列分析
• 2.4 线虫致病性的研究
• 2.4.1 供试马尾松苗
• 2.4.3 线虫的培养及分离
• 2.4.4 线虫的计数
• 2.4.5 接种线虫
• 2.4.6 观察记录
• 3 结果与分析
• 3.1 伞滑刃属线虫形态鉴定
• 3.1.1 松材线虫(Busaphelenchus xylophilius（Steiner & Buhrer,1934）
• 3.1.2 拟松材线虫（Bursaphelenchus mucronatus Mamiya & Enda1979）
• 2.1.3 变异伞滑刃线虫（Bursaphelenchus aberrans）
• 3.1.4 莱鲁尔夫伞滑刃线虫（Bursaphelenchus rainulfi Braassch,2002）
• 3.1.5 泰国伞滑刃线虫（Bursaphelenchu thailandae）
• 3.1.6 霍夫曼伞滑刃线虫（Busaphelenchus hofumanni）
• 3.2 伞滑刃线虫的PCR-RFLP分析
• 3.2.1 伞滑刃属线虫rDNAITS区PCR扩增结果
• 3.2.2 RFLP结果分析
• 3.3 松材线虫和拟松材线虫序列测定及多序列比较
• 3.3.1 PCR扩增目的片段检测
• 3.3.2 rDNA的ITS区序列分析
• 3.4 伞滑刃线虫致病性的研究
• 3.4.1 线虫分离检测结果
• 3.4.2 致病性检测结果
• 4 结论与讨论
• 4.1 伞滑刃属线虫形态鉴定
• 4.2 伞滑刃线虫属PCR—RFLP结果分析
• 4.3 序列分析
• 4.4 伞滑刃线虫属致病性分析
• 参考文献:
• 致谢
• 附录1
• 附录2