论文摘要
乙肝病毒X蛋白结合蛋白（Hepatitis B X-interacting protein, HBXIP）因可与乙肝病毒X蛋白（hepatitis B virus x protein, HBx）的羧基端特异性结合而得名,在细胞凋亡及有丝分裂等细胞生命活动过程中发挥重要作用。我们发现,HBXIP也能促进乳腺癌细胞迁移,但其分子机制尚不清楚。MicroRNA（miRNAs）作为一类小分子非编码RNA,可以参与肿瘤发生、发展等诸多生命活动。本室前期研究发现,在不同转移潜能的乳腺癌细胞系中,HBXIP和miR-520b的表达水平均存在差异,且二者在表达量上呈负相关。本研究以不同转移能力的人乳腺癌细胞系MCF-7、LM-MCF-7及MDA-MB-231为材料,探讨了HBXIP促进乳腺癌细胞迁移的分子机制,并对HBXIP的纯化条件进行了初步探索,主要研究内容如下：1. HBXIP调节乳腺癌细胞迁移的分子机制在前期研究基础上,应用western blot及实时定量PCR法分别检测了三种不同转移能力乳腺癌细胞系中HBXIP和miR-520b的表达水平,发现具有高转移潜能的LM-MCF-7及MDA-MB-231细胞中的HBXIP表达水平明显高于低转移的MCF-7细胞,而miR-520b的表达水平则明显低于MCF-7细胞。这表明HBXIP可能促进乳腺癌细胞迁移,而miR-520b可能抑制乳腺癌细胞迁移。近年来,HBXIP一直是本室的研究重点,为了阐释HBXIP促进乳腺癌细胞迁移的分子机制,我们应用生物信息学方法进行了预测,发现HBXIP是miR-520b的靶基因之一。接下来,我们克隆了HBXIP 3’UTR及其3’UTR突变体的报告基因载体,双荧光素酶报告基因实验及western blot检测结果显示,miR-520b可以靶向HBXIP的3’UTR,影响HBXIP的表达水平。在LM-MCF-7细胞系中共转染miR-520b及pCMV-hbxip-3’UTR（或pCMV-hbxip）后检测细胞的迁移能力,发现,当HBXIP的表达水平被miR-520b下调后,LM-MCF-7细胞系的迁移能力也随之降低,表明HBXIP促进乳腺癌细胞迁移的过程受miR-520b的调控。本实验对HBXIP调节乳腺癌细胞迁移的机理进行了探索,其分子机制是：miR-520b靶向HBXIP的3’UTR,抑制HBXIP的翻译,从而调节乳腺癌细胞迁移。2.HBXIP蛋白纯化条件的探索HBXIP全长173个氨基酸,分子量约19 kDa,几乎表达于高等动物的各种组织中,但在肌肉组织和恶性肿瘤组织中高表达。HBXIP可以参与细胞凋亡中心体复制、细胞迁移、细胞周期等过程,揭示HBXIP的蛋白晶体结构有助于进一步了解HBXIP在细胞生命活动中所发挥的作用。实验中,我们构建了含HBXIP基因全长522bp的原核表达载体pet-28a-HBXIP1和含其C端273bp的原核表达载体pet-28a-HBXIP2,利用亲和层析、分子筛层析、离子交换层析等方法,对His-HBXIP1及His-HBXIP2的纯化条件进行了初步探索。发现,His-HBXIP1经分子筛层析纯化后,吸收峰单一,但蛋白浓度较低；经离子交换层析纯化后,His-HBXIP1穿透明显,蛋白弥散分布。His-HBXIP2的纯化效果与His-HBXIP1情况类似。本实验对HBXIP的纯化条件进行了初步探索,发现His-HBXIP的分子筛层析纯化效果优于离子交换层析。