吸水链霉菌10-22中DNA扩增现象的研究

论文摘要

链霉菌（Streptomyces）属于革兰氏阳性细菌,通常呈丝状,可产生多种次级代谢产物。链霉菌的重要性状之一是基因组的遗传不稳定（Genetic instability）,主要表现为染色体的缺失和DNA扩增。遗传不稳定对链霉菌的形态和代谢都能产生影响,比如形态分化出现异常,次级代谢过程发生改变等。吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）10-22可以产生至少三种抗真菌抗生素。其中5102-I号素（井冈霉素）是一种氨基糖甙类抗生素,可有效防治水稻枯萎病；5102-II号素是多肽类抗生素,对玉米小斑病的防治效果显著。10-22对外源DNA具有很强的限制性,很难被现有质粒转化。在前期研究中,通过自发突变、化学诱变和质粒消除等方法建立了以pIJ702为载体,以10-22的衍生菌株Q105为受体菌的遗传操作系统。研究发现,在10-22的衍生菌株-T110的染色体上发生了高拷贝的DNA扩增,表现为染色体片段与克隆载体的共扩增,可能是一种新的DNA扩增类型。与野生型菌株S. hygroscopicus10-22相比,T110的Asel酶切图谱中缺失了一条300kb的AseI片段,但同时出现了一条约108kb的Asel条带。该10.8kb条带的荧光强度明显与其大小不一致,表明该片段是由多拷贝DNA组成。通过以pIJ702为探针的杂交及测序,发现该10.8kb条带包含了完整的pIJ702和5.11kb的连续的10-22染色体DNA。通过对5.11kb片段进行凝胶回收,以此作为探针从10-22基因文库中钓取到了阳性克隆4D10、17H10和5H8。此前的研究工作已将这三个克隆定位于10-22染色体的300kb片段上,表明10-22的DNA扩增和300kb片段的缺失之间可能存在联系。通过对阳性克隆的测序我们界定了扩增序列在染色体上的插入位点,并根据对插入位点两端序列和5.11kb片段的分析,发现了可能引起DNA扩增的相关序列及编码转座酶的基因。我们对10-22染色体的扩增DNA序列进行生物信息学分析,发现在扩增的10-22染色体DNA中含有一个可能编码转座酶基因的开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）,但除此之外尚未发现其它可能编码完整ORF的序列。利用脉冲场凝胶电泳对10.8kb的Asel片段进行分离、回收,经连接酶连接后电击转化到S. hygroscopicus10-22细胞中,筛选转化子。在部分转化子中发生了DNA的扩增,实现了S. hygroscopicus10-22的DNA扩增重建。通过比较野生型S. hygroscopicus10-22与携带多拷贝扩增DNA的衍生菌株T110的菌落形态、生长曲线以及次级代谢产物的合成等表型,尚未发现直接与DNA扩增相关的表型变化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 前言
• 1.1 链霉菌简介
• 1.1.1 链霉菌所产抗生素及其应用
• 1.1.2 链霉菌育种方法
• 1.2 链霉菌的遗传机制
• 1.3 吸水链霉菌10-22的研究进展
• 1.4 本课题研究的目的、内容和意义
• 1.4.1 研究目的
• 1.4.2 研究内容
• 1.4.3 研究意义
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 菌株和质粒
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 质粒
• 2.2 主要仪器
• 2.3 培养基与溶液
• 2.3.1 培养基
• 2.3.2 溶液
• 2.4 抗生素及其他
• 2.4.1 抗生素
• 2.4.2 其他
• 2.5 实验方法
• 2.5.1 菌体培养和菌种保藏
• 2.5.1.1 大肠杆菌培养和菌种保藏
• 2.5.1.2 链霉菌培养与菌种保藏
• 2.5.2 PFGE法分离链霉菌基因组DNA片段
• 2.5.3 质粒DNA的提取
• 2.5.3.1 大肠杆菌质粒提取（碱裂解法）
• 2.5.3.2 链霉菌质粒提取（小量）
• 2.5.4 链霉菌总基因提取（大量）
• 2.5.5 生物信息学分析与引物设计
• 2.5.5.1 生物信息学分析
• 2.5.5.2 引物设计
• 2.5.6 PCR反应
• 2.5.7 DNA片段的回收
• 2.5.8 大肠杆菌感受态制备及DNA转化
• 2.5.9 链霉菌DNA转化
• 2.5.9.1 PEG介导的原生质体转化
• 2.5.9.2 电击转化（electroporation）
• 2.5.10 Southern杂交
• 第三章 实验结果分析与讨论
• 3.1 T110的DNA扩增
• 3.1.1 T110的DNA扩增
• 3.1.2 T110的DNA扩增与pIJ702的关系
• 3.1.3 T110扩增DNA的结构
• 3.2 基因组插入片段INT的亚克隆及测序
• 3.3 基因组插入片段INT的连续性
• 3.4 pIJ702序列分析
• 3.5 已扩增序列（ADS）的测序分析
• 3.6 染色体上INT邻近DNA序列的分析
• 3.6.1 INT在10-22染色体上的左侧序列（cosmid 4D10）
• 3.6.2 INT在10-22染色体上的右侧序列（cosmid 17H10）
• 3.7 10-22中DNA扩增的重建
• 3.8 T110的扩增机制研究
• 3.8.1 ADS序列中INT不同区域的PCR扩增
• 3.8.2 转化S.lividans 1326菌株
• 3.8.3 转化S.hygroscopicus Q105菌株
• 第四章 总结与展望
• 4.1 工作总结
• 4.1.1 ADS序列和含有扩增序列的文库克隆序列分析
• 4.1.2 DNA扩增对扩增DNA所含基因表达的影响
• 4.1.3 DNA扩增的重建和染色体DNA扩增系统的建立
• 4.2 工作展望
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表