论文摘要
目的探讨重组腺病毒介导的肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor,HGF）对大鼠同种异体心脏移植近期的治疗效果。方法采用改良颈部袖套血管吻合法建立大鼠同种异体心脏移植模型;利用AdEasy重组腺病毒系统将质粒中HGF基因片段,酶切重组后转染293细胞,包装获取表达HGF的重组复制缺陷型腺病毒Ad-HGF;将含有人HGF基因的重组腺病毒的心肌保护液灌注离体供心,进行基因转移,然后异位移植到颈部;术后取移植心作HGF的RT-PCR鉴定,以观察HGF基因的转染情况;于转染后检测HGF蛋白及c-Met受体的表达情况,血浆HGF的水平;观察心肌坏死、炎症细胞的浸润及心肌细胞凋亡情况;测定炎性因子如IL-2、IL-10、IFN-γ等的表达。结果成功建立颈部同种异体心脏移植模型;构建了携带人HGF基因的重组腺病毒（Ad-HGF）; Ad-HGF成功地转染心肌细胞并表达;HGF在心脏移植后,可减轻移植物炎症反应,保护心肌缺血/再灌注损伤,抑制细胞凋亡。结论腺病毒介导的肝细胞生长因子能提高大鼠同种异体心脏移植近期的疗效。第一部分改良法建立大鼠同种异体心脏移植模型【摘要】目的用改进的Heron法,成功建立一个简便、稳定可靠的大鼠同种异体心脏移植模型。方法以SD大鼠为受体,Wistar大鼠为供体,用改进的套管技术通过自制Cuff管将Wistar大鼠供心的升主动脉、肺动脉与SD大鼠受体的右侧颈总动脉、颈外静脉分别进行套接。结果单人操作正式试验86例,成功85例,1例供心出血,手术成功率98.9%。结论应用改良套管法可成功建立大鼠颈部异位心脏移植模型,方法简便、稳定、成功率高;是一种非常实用的心脏移植研究动物模型。第二部分重组腺病毒Ad-HGF的构建【摘要】目的构建携带人肝细胞生长因子（HGF）基因的重组腺病毒（Ad-HGF）并对其进行扩增、纯化与质量检测。方法利用AdEasy重组腺病毒系统将质粒中HGF基因片段,酶切重组后转染293细胞,包装获取表达HGF的重组复制缺陷型病毒Ad-HGF。结果把质粒中HGF基因片段酶切重组后,利用细菌内质粒间同源重组法成功地构建复制缺陷型重组腺病毒载体（Ad-HGF）。结论采用AdEasy重组腺病毒系统载体成功地构建复制缺陷型重组腺病毒载体（Ad-HGF）,为进一步研究HGF基因治疗奠定了基础。第三部分HGF转基因治疗对大鼠同种异体心脏移植急性排斥反应的影响【摘要】目的观察经冠脉内灌注重组腺病毒载体介导HGF（Ad-HGF）转基因治疗对大鼠同种异体心脏移植物急性排斥反应的影响。方法以套管技术建立颈部同种异位心脏移植模型,切取大鼠供心后,实验组在体外经冠脉缓慢灌注含2.5×1010pfu/ml Ad-HGF的4℃Stanford大学液,持续30min,再植入受体大鼠颈部（A组）;空载体组灌注含2.5×1010pfu/ml不携带基因腺病毒载体（Ad）的Stanford大学液（B组）;对照组仅灌注单纯的Stanford大学液（C组）。分别于术后第1、3、7、14天收集移植物组织作检测。组织内目的基因表达情况通过RT-PCR、免疫组化染色进行分析。观察心肌坏死和炎症细胞的浸润情况,测定心肌细胞凋亡。急性反应期相关炎性因子的表达用免疫组化染色进行分析。结果RT-PCR证实移植物内外源性HGF基因转录,免疫组化检测证实Ad-HGF成功转染移植物,HGF蛋白及c-Met受体表达明显,血检测到外源性HGF。A组移植物内心肌坏死和炎症明显轻,心肌细胞凋亡少,移植物平均存活时间（n=6,63±12天）与B组（n=6,7±1.4天,p<0.01）和C组（n=6,8±1.2天,p<0.01）相比明显延长。A组的移植物内IL-2、IFN-γ的表达较B组和C组少,IL-10则较多。结论本研究证实经冠脉灌注重组腺病毒载体介导HGF基因转移到同种心脏移植物是有效可行的,能抑制大鼠同种异体心脏移植急性排斥反应,为心脏移植后增加新的有效的治疗急性排斥反应的方法提供理论依据。
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