小分子化合物J2作用于大鼠角膜细胞的体外及体内实验研究

论文摘要

目的：通过原代培养获得SD大鼠角膜上皮细胞及内皮细胞,应用MTT检测方法研究小分子化合物J2对角膜上皮/内皮细胞的毒性作用,运用流式细胞分析技术检测小分子化合物J2作用后角膜上皮/内皮细胞膜表面CD80分子表达的变化情况,同时应用原子力显微镜观测该化合物对角膜上皮/内皮细胞膜表面超微结构的影响。建立大鼠角膜移植动物模型,在体内观测小分子化合物J2抗移植排斥反应的效果,应用AFM观测该化合物对角膜内皮层细胞超微结构的影响。方法：1、5只SPF级SD大鼠,2%戊巴比妥钠按0.2ml/100g,腹腔麻醉。完整摘除健康大鼠眼球,取下角膜上皮/内皮组织,应用贴壁消化培养法培养角膜上皮/内皮细胞,经免疫组织化学方法鉴定。2、按照MTT比色实验步骤,接种细胞于96孔培养板,培养过夜后,加入小分子化合物J2,于不同观测时间（10min,20min,30min, 1h,2h,4h,8h,16h,32h,48h）,终止实验,每板均设空白对照孔,选择490nnm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值,记录结果。所选实验终止点结束时,对不同观测时间的角膜上皮/内皮细胞应用透射电镜观察小分子化合物J2对细胞形态及细胞内各种细胞器的影响。3、取每只SD大鼠肠系膜下静脉血约5ml,共15只。经密度梯度离心分离法获得单个核细胞,与角膜上皮细胞共培养,加入20000U/L IL-2,500000U/L IFN-γ细胞因子。实验分为三组：A组=MNCs+角膜上皮细胞+小分子化合物J2;B组=MNCs+角膜上皮细胞；C组=角膜上皮细胞（空白对照组）（各实验组均为2ml/培养瓶,共5例,总共10m1）。4、将各组处理好的细胞用流式细胞仪检测CD80分子表达的荧光强度,首先调整细胞密度为1×106/mL,随后进行CD80免疫荧光标记,加入羊抗鼠单克隆抗体工作液0.1mL,室温孵育30min,洗涤1次,弃上清,加入兔抗羊FITC-IgG二抗工作液100μL,避光室温孵育30min,经洗涤弃上清液以除去未结合的荧光二抗,上机进行检测,并设二抗FITC的阴性对照。5、AFM样品的制备和观测：将三组处理好的细胞用PBS液冲洗三遍,以三蒸水浸泡30min,以除去细胞表面残留杂质。2.5%戊二醛溶液固定20min,超净台空间下自然晾干。采用氮化硅探针,100Lm扫描器,悬臂针尖曲率半径10nm,力常数约为10mN/m。应用AFM观测三组细胞膜表面超微结构的改变,以及小分子化合物J2对细胞膜的影响。观测指标为Ra、Rq、Rvm、Rt。6、以同样的方法和步骤对角膜内皮细胞进行MTT实验方法的检测、流式细胞技术分析及原子力显微镜观测。7、建立大鼠同种异体角膜移植动物模型,随机分为三组。A组为小分子化合物J2药物实验组,B组为CsA药物对照组,C组安慰剂对照组。每日滴药次数相同,为4次/d。每日裂隙灯下观察植片情况,根据角膜新生血管评分及植片混浊评分标准判定植片存活时间。免疫组织化学方法测定植片CD80分子表达含量,AFM观测三组角膜植片内皮层细胞超微结构的区别及变化情况。结果：1、经HE染色及免疫组化鉴定,本实验第一部分已成功获得原代培养的SD大鼠的角膜上皮/内皮细胞。角膜上皮细胞形态为长梭形,角膜内皮细胞则呈多角形。2、应用MTT实验方法,测出小分子化合物J2对角膜上皮细胞的IC50值为：10min （4.43±0.59mmol/L）,20min（4.40±0.51mmol/L）,30min（4.31±0.48mmoVL）,1h（4.17±0. 45mmol/L）,2h（4.15±0.46mmol/L）,4h（4.14±0.48mmol/L）,8h（4.12±0.43mmol/L）, 16h（4.09±0.45mmol/L）,32h（4.04±0.44mmol/L）,48h（4.03±0.47mmol/L）。透射电子显微镜可观察到：10mmol/L小分子化合物J2作用30min后角膜上皮细胞的形态由长梭形变为肿胀的圆形,细胞膜表面微绒毛大量脱落,胞内细胞器可见大量空泡形成,线粒体膨胀,伴随内嵴消失；粗面内质网的颗粒脱落消失。3、经流式细胞分析仪检测,A组角膜上皮细胞CD80分子荧光指数为1.944±0.237,B组为3.128±0.175,C组为1.082±0.120。经单因素方差分析,具有统计学方面的差异（F=156.307,P<0.00）。经LSD-t检验各组之间差异均有统计学意义（P<0.05）。4、应用MTT实验方法,测出小分子化合物J2对角膜内皮细胞的IC50值为：10min （3.20±0.33mmol/L）,20min（2.97±0.28mmol/L）,30min（2.88±0.26mmol/L）,1h（2.68±0.25mmol/L）,2h（2.59±0.26mmol/L）,4h（2.58±0.14mmol/L）,8h（2.53±0.17mmol/L）,16h （2.45±0.11mmol/L）,32h（2.44±0.21 mmol/L）,48h（2.43±0.28mmol/L）.透射电子显微镜可观察到：10mmol/L小分子化合物J2作用30min后角膜内皮细胞的形态多边形变为肿胀的椭圆形,细胞膜表面微绒毛大量脱落,胞核未见,可见大量空泡。5、经流式细胞分析仪检测,A组角膜上皮细胞CD80分子荧光指数为2.132±0.173,B组为4.023±0.164,C组为0.985±0.118,经单因素方差分析,具有统计学方面差异（F=4989.799,P<0.00）。经LSD-t检验各组之间差异均有统计学意义（P<0.05）。6、AFM观察角膜上皮细胞,呈长梭形,胞核的大小在14.07μm×20.04μm左右,整个细胞的长度在54.65pm左右,其高度在580-610nm左右。角膜内皮细胞,呈多边形,胞核的大小在17.28μm×20.43μm左右,整个细胞的长度在52.45μm左右,其高度在356nm左右。可发现两种细胞的表面总体较光滑,其表面超微结构显示颗粒状突起。无论是角膜上皮细胞,亦或角膜内皮细胞,经单因素方差分析比较三组Ra、Rq、Rvm、Rt值,认为三组之间存在统计学方面差异。7、三组角膜植片的存活时间为：（A）28.73±0.37d,（B）31.47±0.57d,（C）16.60±0.42d,经Log-Rank分析,三组整体比较差异有统计学意义（F=60.788,P<0.00）;经Log-Rank分析,控制混杂因素后对研究因素各水平间进行两两比较,发现A、B两组之间无统计学差异。经AFM观测可发现三组角膜植片内皮层细胞在超微结构上发生了改变,C组较A、B两组发生了更为显著的变化,A、B两组的观测值在某些数值上无统计学方面差异。结论：1、小分子化合物J2对角膜上皮/内皮细胞的毒性作用并非与时间呈线性相关性,在前1h内,IC50值下降较明显。MTT测试的该结果,可为课题的下一步研究提供可靠的参考数据。2、流式细胞分析检测角膜上皮细胞经MNCs舌化,CD80分子存在高表达;经活化后的角膜上皮细胞,在小分子化合物J2作用下,CD80分子表达有所减少;在角膜内皮细胞测试上,也发现了同样的改变,提示小分子化合物J2可能通过与CD4+T细胞膜表面的CD4D1中的CDR3-CC’袋型结构相结合,阻止TCR与MHC-Ⅱ形成复合物,进而影响共刺激分子的表达,抑制或阻断免疫应答的活化,延缓角膜移植排斥反应的发生。3、应用AFM可以观测到小分子化合物J2对角膜上皮/内皮细胞膜表面超微结构的改变,为AFM对细胞膜表面的观测提供更多更确切的表面信息,从另一层面增加小分子化合物J2对眼角膜上皮/内皮细胞影响的认识。4、经动物模型体内实验进一步证明小分子化合物J2具有抗角膜移植排斥的作用,但与传统药物CsA相比,尚不能证明其作用优于传统药物,考虑为J2剂型以及药物在角膜层代谢动力学的问题,需在下一步的研究过程中进一步改善和探讨。应用AFM可以观测到角膜内皮层细胞在体内实验中超微结构的改变。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 SD大鼠角膜上皮细胞及内皮细胞的原代培养及鉴定
• 引言
• 材料和方法
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要仪器与器械
• 1.3 实验试剂
• 1.4 实验方法及步骤
• 结果
• 1.1 倒置显微镜观察SD大鼠角膜上皮细胞及内皮细胞的形态
• 1.2 HE染色结果
• 1.3 免疫组化染色结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 小分子化合物J2对SD大鼠角膜上皮细胞和内皮细胞毒性作用的研究
• 引言
• 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要仪器与器械
• 2.3 实验试剂
• 2.4 实验方法及步骤
• 2.5 实验数据的处理及MTT测试结果的计算
• 结果
• 2.1 角膜上皮/内皮细胞MTT测试结果分析
• 2.2 倒置显微镜及透射电子显微镜下角膜上皮/内皮细胞形态学观察结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 小分子化合物J2对体外培养SD大鼠角膜上皮细胞 CD8O分子表达的影响
• 引言
• 材料和方法
• 3.1 实验材料
• 3.2 主要仪器与器械
• 3.3 实验试剂
• 3.4 实验方法及步骤
• 3.5 统计分析
• 结果
• 3.1 流式细胞仪检测角膜上皮细胞CD80分子表达结果
• 3.2 应用AFM观察角膜上皮细胞膜表面超微结构及测量参数的统计结果
• 讨论
• 3.1 流式细胞分析仪检测角膜上皮细胞膜表面CD80分子表达
• 3.2 原子力显微镜观察小分子化合物J2对角膜上皮细胞膜表面超微结构的影响
• 3.3 应用AFM观测三组角膜上皮细胞的相关参数存在显著性差异
• 小结
• 第四部分 小分子化合物J2对体外培养SD大鼠角膜内皮细胞CD80分子表达的影响
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 4.1 流式细胞仪检测角膜内皮细胞CD80分子表达结果
• 4.2 应用AFM观察角膜内皮细胞膜表面超微结构及测量参数的统计结果
• 讨论
• 4.1 流式细胞分析仪检测角膜内皮细胞膜表面CD80分子表达
• 4.2 原子力显微镜观察小分子化合物J2对角膜内皮细胞膜表面超微结构的影响
• 4.3 应用AFM测得三组角膜内皮细胞的相关参数存在显著性差异
• 小结
• 第五部分 小分子化合物J2在动物模型中抗角膜移植排斥效果研究
• 引言
• 材料和方法
• 5.1 实验动物及分组情况
• 5.2 实验药品的配制
• 5.3 主要手术仪器及手术器械
• 5.4 主要手术药品
• 5.5 手术术前准备及手术方法
• 5.6 角膜植片标本制备及观察
• 5.7 AFM样品的制备和观测
• 5.8 记录角膜植片存活时间,收集AFM观测数据及进行统计学分析方法
• 结果
• 5.1 PKP术后角膜植片裂隙灯下临床观察
• 5.2 PKP术后三组角膜植片存活时间记录及统计学分析结果
• 5.3 PKP术后三组角膜植片HE组织学观察
• 5.4 AFM观测三组角膜植片角膜内皮层超微结构的差异
• 5.5 三组角膜植片AFM观测指标的收集及统计学分析
• 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 文献综述 同种异体角膜移植术后角膜内皮细胞的特征表现
• 参考文献
• 就读期间发表文章
• 致谢