草甘膦氧化还原酶基因转化油菜的研究

论文摘要

本研究根据草甘膦氧化还原酶GOX基因的序列设计一对引物,以转基因抗除草剂油菜的总DNA为模板进行PCR扩增,克隆出GOX基因全长编码区,长度为1296bp。将此基因插入含有启动子CaMV35S与终止子NOS序列的pPZP221中,构建植物表达载体pPZP221-GOX。以甘蓝型油菜区试00S-76,太空3-19,繁4,繁5四种材料为受体,以植物表达载体pPZP221-GOX为外源基因供体,进行了花粉管通道法转基因研究。在授粉后20h,24h,30h,采用不切柱头和切去柱头上端1/3部分的2种方法,立即在柱头上滴加质粒DNA溶液,成熟后收获转化种子。对T0代植株进行PCR检测,结果表明授粉后20h、24h和30h导入所获得的阳性率分别为1.1%、3.2%和1.4%。不同处理方法比较结果表明,切去1/3柱头后导入所获得的阳性率较高,达到3.0%,而未切去柱头,其阳性率为1.0%。为了鉴定T0代植株的抗性,经160mg/L庆大霉素和0.02%草甘膦筛选培养,分别得到0.7%和1.2%的抗性苗。花粉管通道法简单、易操作,是一种经济、有效、具有广泛应用价值的技术,避免了传统的农杆菌介导法和基因枪法转化所要求的组织培养技术。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 供试植物材料
• 1.2 菌种与质粒
• 1.3 试剂
• 1.4 引物
• 2 方法
• 2.1 油菜总DNA提取
• 2.2 草甘膦氧化还原酶基因GOX的克隆
• 2.3 表达载体构建
• 2.4 花粉管通道法导入表达载体
• 0代植株的PCR检测'>2.5 T₀代植株的PCR检测
• 2.6 油菜选择压的确定
• 0代植株的抗性鉴定'>2.7 T₀代植株的抗性鉴定
• 结果与分析
• 1 GOX基因克隆
• 1.1 油菜总DNA提取
• 1.2 PCR扩增获得GOX基因
• 1.3 重组质粒的筛选与鉴定
• 1.4 草甘膦氧化还原酶基因GOX序列分析
• 2 表达载体构建
• 2.1 表达载体pPZP221-GOX的PCR鉴定
• 2.2 表达载体pPZP221-GOX的酶切鉴定
• 0代植株的检测'>3 T₀代植株的检测
• 3.1 结角果率的统计
• 3.2 转化时间对结角果率的影响
• 0代植株的PCR检测'>3.3 T₀代植株的PCR检测
• 0代植株的抗性鉴定'>4 T₀代植株的抗性鉴定
• 4.1 庆大霉素选择压的确定
• 4.2 除草剂草甘膦选择压的确定
• 0代植株的抗性鉴定'>4.3 T₀代植株的抗性鉴定
• 讨论
• 1 花粉管通道法转化效率的影响因素
• 2 油菜的抗性筛选浓度确定
• 3 抗草甘麟转基因油菜的分子检测和抗性检测
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢