线粒体功能障碍在足细胞损伤中的作用及干预研究

论文摘要

蛋白尿是儿童肾脏病最常见的临床表现之一,其不仅是肾损伤的重要评判指标,且作为独立因素参与肾脏病变过程,是慢性肾脏病进展的危险因素。蛋白尿的产生主要由于肾小球滤过屏障功能受损所致。肾小球滤过屏障包括五层结构,依次为内皮细胞表面膜结构、内皮细胞及内皮细胞窗孔、肾小球基底膜、足细胞下间隙和足细胞[1]。现有研究发现,足细胞是影响蛋白尿发生的关键结构,保护足细胞免受损伤是减少蛋白尿、阻断慢性肾脏病发生发展的关键所在,其将成为蛋白尿治疗的新靶点。足细胞,即肾小球脏层上皮细胞,是高度分化的终末细胞,主要作用包括参与基底膜合成、调控肾小球选择通透性,这些作用均依赖于足细胞的分化成熟及特殊蛋白分子的表达。现认为微小病变（minimal change disease, MCD）、局灶节段性肾小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis, FSGS）、膜性肾病（membranous nephropathy, MN）、IgA肾病、糖尿病肾病、HIV相关性肾病等均与足细胞损伤密切相关,但损伤机制尚不十分明确。线粒体功能障碍近年来在肾损伤中的作用引起了广泛关注。2000年,Doleris LM等[2]报道了4例线粒体细胞病患者并发有局灶节段性肾小球硬化,最终进展为终末期肾衰竭。随后,有研究报道FSGS患者存在线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）突变并伴有足细胞中线粒体形态异常[3]。直到2006年Hagiwara才首次报道FSGS存在线粒体功能障碍,该学者在嘌呤霉素诱导的FSGS大鼠中发现肾组织中线粒体氧化磷酸化功能、mtDNA拷贝数均显著减低并出现mtDNA突变和足细胞凋亡,提示线粒体功能障碍与足细胞损伤关系密切。因此,深入研究足细胞线粒体功能,不仅为足细胞损伤机制提供新视点,还可为足细胞及蛋白尿治疗提供新靶点。目的:探讨线粒体功能障碍在醛固酮（aldosterone,Aldo）介导的肾小球足细胞损伤中的作用及机制。方法:通过腹腔埋置含Aldo的渗透性微泵构建Aldo肾损伤小鼠模型,随机分为2组:假手术组（Sham）、Aldo组。体外培养小鼠肾小球足细胞系MPC5,分为正常对照组、Aldo组;此外,足细胞瞬时转染pcDNA3-h TFAM（线粒体转录因子A）质粒载体,分为正常组、Aldo组、TFAM过表达组、TFAM过表达+Aldo组。应用real-time PCR和western blot法检测足细胞和肾皮质裂孔隔膜蛋白Nephrin、P-cadherin、ZO-1和间充质标志蛋白Fibronectin、Desmin的表达;采用荧光探针2,7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸（DCFDA）检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生;电镜检测足细胞线粒体形态的改变;荧光素酶法检测细胞内ATP含量;JC-1染色结合流式细胞术检测线粒体膜电位;real-time PCR检测线粒体DNA（mtDNA）拷贝数;real-time PCR和western blot方法检测足细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子α（peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α,PGC-1α）和线粒体转录因子（mitochondrial transcription factor A,TFAM）的表达。结果:（1） Aldo呈时间依赖性和剂量依赖性地抑制足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin、P-cadherin、ZO-1的表达、促进间充质标志蛋白Fibronectin、Desmin的表达;（2）电镜下,Aldo小鼠肾小球足细胞足突广泛融合、部分消失;肾皮质Nephrin、P-cadherin、ZO-1表达下降,Fibronectin、Desmin表达增加;（3） 100 nmol/L Aldo刺激12h后足细胞内线粒体数目减少、线粒体肿胀、髓样化,伴线粒体嵴消失,ROS生成增加,线粒体膜电位、mtDNA拷贝数、ATP含量、PGC-1α和TFAM表达均明显下降;（4） TFAM过表达可逆转Aldo诱导的线粒体膜电位和mtDNA拷贝数下降,上调足细胞Nephrin表达。结论:线粒体功能障碍参与Aldo介导的肾小球足细胞损伤。目的:观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）激动剂罗格列酮（rosiglitazone,Rosi）对Aldo诱导足细胞损伤和线粒体功能障碍的保护作用。方法:通过腹腔埋置含Aldo的渗透性微泵构建Aldo肾损伤小鼠模型,随机分为3组:假手术组（Sham）、Aldo组、Rosi干预组。于第15天处死小鼠,检测尿蛋白/肌酐;HE和PAS染色观察肾组织病理形态学改变;电镜观察足细胞超微结构。体外培养小鼠肾小球足细胞,分别以Rosi、Aldo、Aldo+Rosi、Aldo+EPL（eplerenone）、Aldo+ROT（rotenone）干预;瞬时转染pcDNA3.1-PPARγ或PPARγsiRNA质粒载体,再分别加入Rosi、Aldo、Aldo+Rosi干预。应用real-time PCR和western blot法检测足细胞和肾皮质裂孔隔膜蛋白Nephrin、P-cadherin、ZO-1和间充质标志蛋白Fibronectin、Desmin的表达。采用荧光探针DCFDA检测ROS的变化;电镜检测线粒体形态改变;荧光素酶法检测ATP含量;JC-1染色流式细胞仪检测线粒体膜电位;real-time PCR检测mtDNA拷贝数,以及采用real-time PCR和western blot方法检测PGC-1α和TFAM的表达。ELISA法检测尿F2-异前列腺素,化学发光法检测肾皮质丙二醛含量。结果:（1） Rosi预处理显著抑制Aldo诱导足细胞Nephrin表达下降;足细胞表达PPARγ,Aldo（100 nmol/L）下调PPARγ表达,Rosi（5μmol/L）上调PPARγ表达;（2） Rosi（5μmol/L）逆转Aldo（100 nmol/L）诱导的足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin、P-cadherin、ZO-1和间充质标志蛋白Fibronectin、Desmin的表达;（3）构建Aldo小鼠模型,发现Rosi可显著抑制Aldo小鼠尿蛋白排泄、肾组织病理损伤及足细胞特异性蛋白表达改变;（4）线粒体呼吸链抑制复合体I抑制剂Rotenone、盐皮质激素受体拮抗剂依普利酮（eplerenone,EPL）、PPAR?激动剂Rosi均可有效抑制Aldo诱导的ROS生成;（5） EPL干预部分逆转线粒体超微结构改变,线粒体膜电位、PGC-1α、TFAM、mtDNA拷贝数和ATP含量均显著上调;（6） Rosi干预或体外诱导PPARγ过表达部分逆转线粒体超微结构改变,线粒体膜电位、PGC-1α、TFAM、mtDNA拷贝数和ATP含量均显著上调;体外瞬时转染PPAR siRNA,可抑制Rosi对线粒体功能的保护作用;（7）体内实验结果显示Rosi可抑制小鼠尿F2-异前列腺素、肾皮质丙二醛、ROS生成,上调线粒体膜电位、mtDNA拷贝数和ATP含量、PGC-1α、TFAM表达。结论:Aldo通过与盐皮质激素受体结合,促进线粒体源性ROS增加、诱导线粒体功能障碍,引发足细胞损伤;Rosi则通过PPARγ结合,抑制线粒体源性ROS增加、改善线粒体功能,从而保护足细胞免受损伤。目的:探讨槐杞黄清膏（Huai Qihuang,HQH）对阿霉素（adriamycin,ADR）诱导足细胞损伤的干预作用,并初步探讨其对线粒体功能的影响。方法:雄性SD大鼠18只,随机分为:正常对照组、阿霉素肾病组、槐杞黄清膏治疗组。于第7天和第14天留取24 h检测尿蛋白排泄,并于第15天处死大鼠,PAS染色观察肾组织病理形态学改变;透射电镜观察肾小球足细胞损伤;real-time PCR和western blot法检测肾皮质Nephrin、Podocin、PGC-1α和TFAM的表达;免疫组织化学法和western blot法检测巨噬细胞浸润;ELISA检测血清TNF-α和IL-1β含量。体外培养肾小球足细胞,采用real-time PCR和western blot法检测足细胞Nephrin、Podocin、PGC-1α和TFAM的表达,应用real-time PCR检测足细胞mtDNA拷贝数、TNF-α和IL-1βmRNA表达,ELISA法检测细胞上清液TNF-α和IL-1β含量。结果:（1）阿霉素肾病大鼠出现尿蛋白排泄增加,电镜下见足细胞足突广泛融合、消失,槐杞黄清膏治疗组尿蛋白排泄显著减少,足细胞足突仅见灶性融合;（2）阿霉素肾病大鼠肾皮质Npehrin和Poocin表达显著降低,而槐杞黄清膏治疗大鼠肾皮质Npehrin和Poocin表达明显高于模型组;（3）与阿霉素肾病组相比,槐杞黄清膏可显著抑制肾组织巨噬细胞浸润、降低血清TNF-α和IL-1β分泌;（4）阿霉素肾病大鼠肾皮质线粒体生物合成调节因子PGC-1α、TFAM表达和mtDNA拷贝数下降,槐杞黄清膏部分上调PGC-1α、TFAM表达和mtDNA拷贝数;（5）体外培养肾小球足细胞,发现槐杞黄清膏可抑制阿霉素诱导的足细胞Nephrin和Podocin表达下降,抑制足细胞TNF-α和IL-1β表达,上调PGC-1α和TFAM表达,促进mtDNA拷贝数增加。结论:阿霉素诱导蛋白尿和足细胞损伤,促进炎症反应,诱导线粒体功能障碍;槐杞黄清膏通过抑制炎症反应、阻断线粒体功能障碍减轻阿霉素霉素诱导的蛋白尿和足细胞损伤。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 线粒体功能障碍参与醛固酮介导的足细胞损伤
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 罗格列酮通过阻断线粒体功能障碍减轻醛固酮诱导的足细胞损伤
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 槐杞黄清膏对阿霉素诱导足细胞损伤和线粒体功能障碍的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文小结
• 研究创新点
• 参考文献
• 英文缩略词
• 综述1
• 参考文献
• 综述2
• 参考文献
• 附录
• 致谢