费氏中华根瘤菌RT19与耐盐有关基因的克隆和功能研究

论文题目: 费氏中华根瘤菌RT19与耐盐有关基因的克隆和功能研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 姜巨全

导师: 杨苏声

关键词: 费氏中华根瘤菌,耐盐,单价阳离子,氢离子逆向转运蛋白,甲硫氨酸合成酶

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii) RT19是分离自天津盐碱地的快生大豆根瘤菌,能耐受高达0.6mol/LNaCl。本论文利用Tn5-1063a转座子对该菌株进行随机突变,建立了一个容量达30,000个突变株的库,从中筛选获得在0.4mol/L NaCl的FY培养基上不能生长的盐敏感突变株21株。利用Tn5-1063a能够自连成质粒和自我复制的功能,对突变株的基因组DNA进行酶切和自连,并对Tn5插入位置侧翼序列进行测序。结果发现,21株突变株是由于5个基因突变所致,它们是phaA2、phaD2、phaF2、phaG2和metH。其中,有8个突变株是因phaA2突变所致,7个突变株是因phaD2突变所致,2个突变株是因phaF2突变所致,2个突变株是因phaG2突变所致。另外,2个突变株是因metH突变所致。将与phaA2有关的突变株分别命名为RTa-1至RTa-8,将与phaD2有关的突变株分别命名为RTd-1至RTd-7,将与phaF2有关的突变株分别命名为RTf-1和RTf-2,将与phaG2有关的突变株分别命名为RTg-1和RTg-2,而将与metH有关的突变株分别命名为RTh-1和RTh-2。 对pha2有关的4个基因及侧翼序列进行分析,发现它们与其它3个基因phaB2、phaC2和phaE2共同构成一个基因簇,并在同一个启动子的控制下进行转录。同源性分析显示,pha2基因簇分别与已经进行全基因组测序的苜蓿中华根瘤菌(S. meliloti)1021的编码不同的阳离子输出系统蛋白pha2基因簇有最高的同源性。此外,它们与已经完成全基因组测序的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefacies)C58的编码多亚基的钠离子/氢离子逆向转运蛋白的mnh操纵子以及伯氏立克次氏体(Coxiella burnetii)RSA493的编码单价阳离子/氢离子逆向转运蛋白nha基因簇也有相当高的同源性。对metH基因进行分析和同源性比较,发现它与苜蓿中华根瘤菌1021编码甲硫氨酸合成酶Ⅱ的基因有最高的同源性。 对不同的无机离子和有机试剂对盐敏感突变株生长影响的测定结果表明,所有pha2突变株在0.1mol/L NaCl和LiCl的FY培养基上仍不能生长并且在含有高浓度KCl的FY培养基上表现出一定的生长抑制,说明pha2基因簇对费氏中华根瘤菌RT19的耐盐能力具有重要的作用。相比之下,metH突变株则在各种高浓度的渗透压力下都出现生长抑制现象。此外,当加入甲硫氨酸、胆碱以及甘氨酸甜菜碱时,能不同程度地恢复突变株在NaCl存在时的生长,这些表明metH基因可能与渗调机制有关。 鉴于pha2基因共同构成一个基因簇,我们将其整体克隆到穿梭载体pBBR1-MCS5上,得到含有完整pha2基因簇的载体,将其命名为pMCS5-ZEd-1-ZCa-3。利用三亲本杂交技术,将pMCS5-ZEd-1-ZCa-3转入所有pha2突变株,结果使它们都完全恢复到原有的耐盐水平。将采取PCR方法克隆的metH基因连接到pBBR1-MCS5上,得到pMCS5-metH,然后通过三亲本杂交转入metH突变株,结果发现metH突变株在含有0.4mol/LNaCl的固体平板上恢复生长。 为了证明pha2基因簇编码不同的阳离子输出蛋白,我们测试了RT19野生型和突变株的细胞内的离子含量,结果发现pha2突变株随时间的增加不断积累钠离子和锂离子,而不积累钾离子,这充分说明了pha2基因簇与钠、锂离子输出有关。由于该基因簇与编码多亚基的钠离子/氢离子逆向转运蛋白的mnh操纵子和编码单价阳离子/氢离子逆向转运蛋白nha基因簇有很高的同源性,我们进一步测定了RT19野生型和突变株的单价阳离子/氢离子逆向转运蛋白的活性,发现野生型

论文目录:

第一章 绪论

1.1 本论文研究的理论和应用意义

1.2 细菌渗透调节机制

1.2.1 亲和性溶质

1.2.2 外膜孔道蛋白(porin)：OmpC和OmpF

1.2.3 壁膜间隙葡聚糖

1.3 细菌中的阳离子运输蛋白或系统

1.3.1 钾离子运输蛋白或系统

1.3.2 钠(锂)离子运输蛋白

1.4 σ转录因子的全细胞调控作用

1.4.1 σ~S全细胞调节因子

1.4.2 σ~E转录因子

1.4.3 σ~B转录因子

1.4.4 σ~M转录因子

1.5 转座子和转座子标签法

1.5.1 细菌转座子的插入机制和随机诱变作用

1.5.2 转座子标签技术

1.5.3 pRL1063a在基因分离上的独特优势

1.6 本论文的研究路线与目标

第二章 费氏中华根瘤菌RT19盐敏感突变株的获得及其生长测定

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 方法

2.3 结果

2.3.1 pRL1063a的酶切鉴定实验

2.3.2 RT19对不同抗生素的抗性

2.3.3 大肠杆菌在FY培养基上生长的排除

2.3.4 盐敏感突变株的获得及其耐盐性生长测定

2.3.5 盐敏感突变株在其它渗透压力下的生长

2.4 讨论

第三章 费氏中华根瘤菌RT19与耐盐有关基因的测序与序列分析

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 方法

3.3 结果

3.3.1 突变株中Tn5插入的验证

3.3.2 总DNA酶切后自连成质粒并转化感受态细胞

3.3.3 Tn5-1063侧翼DNA序列的测序

3.3.4 基因的序列分析及其蛋白同源性比较

3.3.5 pha2基因簇编码的7个蛋白的疏水性分析

3.3.6 pha2基因簇编码的7个蛋白二级结构的在线推测

3.4 讨论

第四章 pha2基因簇和metH基因的克隆及功能互补

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 pha2基因簇的克隆

4.3.2 metH基因的克隆

4.3.3 pha2基因簇与相应突变株的互补实验

4.3.4 metH基因与相应盐敏感突变株的互补实验

第五章 pha2基因簇和metH基因的功能的鉴定

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 材料

5.2.2 方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 RT19与pha2盐敏感突变株细胞内阳离子含量的差异

5.3.2 RT19和pha2突变株单价阳离子／氢离子逆向转运蛋白活性的测定

5.3.3 metH基因功能的鉴定及其与耐盐性的关系

结论

参考文献

致谢

作者简介

发布时间: 2005-07-18

参考文献

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