环境雌激素对小鼠生殖系统雄激素受体影响的实验研究

论文摘要

目的:流行病学研究显示近几十年来男性生殖系统畸形发生率明显增高[1],且与胎儿期母体及胎儿的环境雌激素（environmentl estrogens,EEs）暴露有关,但EEs对生殖系统发育影响的机理却很不清楚。近来研究表明,生殖股神经（genitofemoral nerve ,GFN）接受睾丸分泌的雄激素的影响,并通过其神经纤维释放神经递质降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）作用于睾丸引带,使睾丸引带产生收缩和运动效应,从而参与调节睾丸的下降[2]。形成了新的调节睾丸下降发育的“睾丸-GFN-睾丸引带”轴。环境雌激素会对生殖系统的发育产生影响,其机理复杂,是否通过了对该轴（途径）的影响目前尚不清楚。本实验拟采用公认的代表性EEs己烯雌酚（diethylstilbestrol,DES）作用于孕期母鼠,通过检测不同发育阶段雄性仔鼠中睾丸、睾丸引带以及位于脊髓前角的生殖股神经细胞中雄激素受体的变化情况以了解EEs是否会对这条影响睾丸下降和发育的途径产生影响。材料和方法:810周龄健康雌性昆明小鼠120只随机分为8组:实验组1-6分别给予DES 0.1、0.5、10.0、25.0、50.0、100.0μg.kg-1.d-1。对照组仅给予DMSO和NS;正常组不给任何药物。小鼠按雌雄比例2:1合笼,以检查发现阴栓作为受孕标志,定为妊娠第0天,记为GD0（gestation day,GD）。GD9至GD17上午8时皮下注射给药,每组所用的DES均溶于等量的DMSO及NS中,以保证每次每只小鼠每千克体重给予相同量的DMSO和NS。以小鼠出生当天记为生后0天,计为PD0（postnatal day,PD）。分别于GD17、GD19、PD0、PD3、PD7时取材:上腹部横断,取下半部分用10%福尔马林固定、取材。作4μm厚冠状位连续切片进行常规HE染色观察和特殊的免疫组织化学研究。光镜观察睾丸、睾丸引带及脊髓前角的组织结构变化,免疫组织化学方法检测各组睾丸、睾丸引带及脊髓前角生殖股神经（GFN）运动神经细胞中的雄激素受体（androgen receptor, AR）表达情况,测定各部位AR指标的阳性灰度值,以Χ±s表示,采用SPSS for windows 10.0统计软件进行多个处理组与一个对照组比较的方差分析方法进行比较,并采用相关分析和回归分析进行统计学检验,而不同剂量及不同发育阶段小鼠睾丸、睾丸引带、脊髓前角AR含量的变化情况则采用t检验。结果:1.显微形态学观察:①睾丸:正常组、对照组睾丸的生精小管形态正常,但在100.0和50.0μg.kg-1.d-1组出现睾丸生精细胞层减少、稀疏,睾丸生精细胞脱落至管腔;睾丸生精上皮出现多核细胞。②睾丸引带:a,正常组及对照组睾丸引带发育良好,引带球呈类圆形由两部分构成:中心为间叶组织,外周为肌细胞,两者之间分界清楚;DES处理组可见睾丸引带发育不良,形态不规则,间叶组织与肌层细胞之间无明显分界,组织结构紊乱,DES剂量越大,结构紊乱现象越明显;b,GD17时睾丸引带呈类圆型,体积大,随年龄增长呈现出先增大变圆后缩小退化的趋势。PD7时大部分睾丸引带已经退化,仅剩余形态不规则的纤维结蒂组织。③脊髓前角:a,正常组、对照组及低剂量实验组的脊髓前角GFN运动神经元细胞形态、数量上无明显差异,但在50.0和100.0μg.kg-1.d-1组出现GFN运动神经细胞数量减少、稀疏、细胞体积增大、不规则;b,GD19时脊髓前角GFN运动神经细胞密集,形态规则,随着天数增加,其数量逐渐减少,细胞体积增大。P7D时细胞数量减少明显,体积增大。2.免疫组织化学检测:①在正常组和对照:a,睾丸AR出生前表达较弱,出生后表达迅速增强,有随年龄增长而增加的趋势;b,睾丸引带AR出生前随睾丸引带的生长而表达迅速增加,出生后随睾丸引带逐渐退化而迅速减少;c,脊髓前角GFN运动神经细胞AR出生前随睾丸引带的生长而表达迅速增加,出生后随睾丸引带逐渐退化而迅速减少。②在相同发育阶段不同剂量DES影响下,睾丸、睾丸引带及脊髓前角GFN运动神经细胞AR的表达呈现出相似的变化趋势:低剂量实验组（DES 0.1和0.5μg.kg-1.d-1组）AR灰度值与正常组、对照组比较变化不明显（P>0.05）,中、高剂量实验组（DES 10.0、25.0μg.kg-1.d- 1组及50.0、100.0μg.kg-1.d-1组）AR灰度值低于正常组和对照组,且随着DES剂量的增加其表达水平逐渐降低,其降低幅度有显著的统计学差异（P<0.05）;③在不同剂量DES影响下,相同发育阶段的睾丸、睾丸引带、脊髓前角GFN运动神经细胞3个部位的AR表达变化情况正性相关,具统计学意义。结论:1. DES可致小鼠睾丸、睾丸引带发育不良、形态异常、组织结构紊乱,且与剂量关系密切;高剂量DES可致脊髓前角GFN神经细胞稀疏,体积增大,提示环境雌激素能够影响睾丸、睾丸引带以及脊髓GFN运动神经元细胞的发育,对“睾丸-GFN-睾丸引带”轴有形态学上的不良影响。2. AR表达于睾丸间质细胞、睾丸引带中央的间充质细胞及脊髓前角GFN运动神经细胞,与正常组及对照组比较,实验组AR表达均明显受抑制,且随着剂量的增加抑制作用越明显,有剂量效应关系。3.随着小鼠天龄的增加,睾丸中AR表达逐渐增加,睾丸引带中AR则呈现出先增加后逐渐减少的趋势,脊髓前角GFN运动神经细胞AR表达逐渐下降。结合睾丸以及睾丸引带、脊髓前角的形态学变化,表明“睾丸-GFN-睾丸引带”在生殖系统正常发育过程中关系密切,确是调节睾丸下降的一条完整轴线（途径）。4.不同发育阶段的小鼠睾丸、睾丸引带、脊髓前角GFN运动神经细胞的AR表达量在不同剂量环境雌激素影响下均发生改变,且三者间的变化呈正相关,结合形态学改变,也从AR代谢的角度证实了“睾丸-GFN-睾丸引带”轴的存在,并表明环境雌激素会对该轴线产生影响,提示环境雌激素可能通过对AR的调节来影响GFN介导的睾丸下降发育过程。

论文目录

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