纤维素酶高产菌株的选育及其酶活提高的机理初探

论文摘要

随着经济的发展和社会的进步,化石能源渐趋枯竭,寻求更加安全、环保和高性价比的新型可再生能源以期部分替代化石能源成为目前亟待解决的问题。纤维素是自然界中含量最丰富、分布最广泛的可再生资源。纤维素能够被纤维素酶降解为可发酵的多糖、单糖等糖浆混合物,进一步发酵生产清洁燃料乙醇。但是纤维素酶的生产成本高成为将纤维素转化为燃料乙醇的瓶颈问题。因此纤维素酶高产菌株的选育和酶活提高机理研究具有重要的经济效益和社会意义。本文通过刚果红染色法、酶活测定在福建永泰温泉中筛选出14株降解纤维素的嗜热菌。对其中2株进行18S rDNA鉴定,YT-40-1和WJM-4-G分别属于假丝酵母（Candida parapsilosis）和阿氏丝孢酵母菌（Trichosporon asahii）。对它们进行了培养温度、培养初始pH值和发酵时间对产纤维素酶影响的研究。结果表明:YT-40-1在培养24h时进入对数生长期,反应温度是50℃,培养时间为72h,最适培养基初始pH值是4时酶活最高;WJM-4-G培养24h后开始进入对数生长期,最适产酶条件为:反应温度是40℃,培养时间为60h,最适培养基初始pH值是4和7。对菌株YT-40-1、WJM-4-G和CC-1采用物理、化学方法诱变。菌株YT-40-1通过氯化锂诱变获得三株菌:在0.3%时有两株菌（1-0.3-1和1-0.3-4）β-葡萄糖苷酶活分别达到669.0U和717.5,比出发菌分别提高了96.1%和110.3%, CMC酶活分别是121.9U和125.3U,比出发菌株酶活提高了72.1和74.0%;通过等离子体诱变在气体流量为15L/min诱变7min时筛选出一株酶活较高的菌株YT-40-1（15-7-Ⅲ）,β-葡萄糖苷酶活和CMC酶活分别达到571.2U和152.8U,比出发菌株分别提高了27.2%和73%。菌株WJM-4-G通过硫酸二乙酯诱变20min时筛选到一株菌β-葡萄糖苷酶活达到555.9U, CMC酶活是148.7U;处理25min时筛选到一株菌β-葡萄糖苷酶活达到550.2U, CMC酶活是144.1U;经过紫外诱变10min后再在含0.3%氯化锂的平板培养基上生长筛选出一株菌菌G-10-Li,β-葡萄糖苷酶活和CMC酶活分别达到438.1U和184.0U比出发菌株分别提高了27%和131.4%。菌株通过紫外线诱变10min筛选到一株菌CC-1-10,β-葡萄糖苷酶活和CMC酶活分别达到511.1U和155.6U,比出发菌株分别提高了20.4%和55.6%。全菌蛋白SDS-PAGE分析和随机扩增DNA多态性分析（RAPD）表明YT-40-1的出发菌株和突变株YT-40-1（15-7-Ⅲ）蛋白条带有明显不同,DNA随机扩增也有条带差异,这就分别从蛋白质水平和基因组水平上证明了突变株YT-40-1（15-7-Ⅲ）确实是出发菌株YT-40-1遗传物质发生改变的菌株。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 纤维素的研究进展
• 1.1.1 纤维素的性质
• 1.1.2 纤维素的降解
• 1.2 纤维素酶研究进展
• 1.2.1 纤维素酶来源
• 1.2.2 纤维素酶的分离纯化
• 1.2.3 纤维素酶的理化性质
• 1.3 微生物育种进展
• 1.4 诱变机理
• 1.5 剂量的选择
• 1.6 纤维素降解菌的选育研究进展
• 1.7 本研究的目的意义和研究内容
• 2 纤维素降解嗜热菌的筛选
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 培养基
• 2.1.2 主要试剂的配制
• 2.1.2.1 三硝基水杨酸试剂（DNS）
• 2.1.2.2 Tris-HCl 缓冲溶液（pH7.0）
• 2.1.2.3 1mg/ml 标准葡萄糖溶液
• 2.1.2.4 测酶活溶液
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 样品采集及处理
• 2.2.2 纤维素降解菌的分离纯化
• 2.2.3 纤维素降解嗜热菌的筛选
• 2.2.4 菌株的复筛
• 2.2.4.1 葡萄糖标准曲线的制定
• 2.2.4.2 粗酶液的制备
• 2.2.4.3 酶活测定
• 2.3 结果分析与讨论
• 2.3.1 纤维素降解嗜热菌初筛结果
• 2.3.2 纤维素降解嗜热菌的复筛
• 2.3.2.1 葡萄糖标准曲线的制作
• 2.3.2.2 酶活复筛结果
• 3 菌株YT-40-1 和WJM-4-G 的鉴定及生物信息学分析
• 3.1 实验材料及仪器
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.1.1 实验菌株及载体
• 3.1.1.2 培养基
• 3.1.1.3 实验试剂
• 3.1.1.4 常用溶液配制
• 3.1.1.5 引物
• 3.1.2 实验仪器
• 3.2 菌株YT-40-1 和WJM-4-G 的形态学鉴定
• 3.2.1 菌株YT-40-1 和WJM-4-G 的形态学观察
• 3.2.2 光学显微镜盖片观察菌体及孢子形态
• 3.3 菌株YT-40-1 和WJM-4-G 的分子鉴定
• 3.3.1 菌株的培养
• 3.3.2 DNA 提取
• 3.3.3 ITS rDNA 基因的PCR 扩增
• 3.3.4 PCR 结果检测
• 3.3.5 PCR 产物回收
• 3.3.6 连接反应
• 3.3.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.3.8 连接产物的转化
• 3.3.9 质粒小量提取
• 3.3.10 菌液PCR 验证
• 3.3.11 双酶切验证
• 3.3.12 核酸序列测定与序列比对分析
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 菌株YT-40-1 和WJM-4-G 的形态学鉴定
• 3.4.2 菌株的分子鉴定
• 4. TY-40-1 和WJM-4-G 的产酶条件优化
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 菌种的制备
• 4.2.2 菌体生长曲线测定
• 4.2.3 产酶条件测定
• 4.2.3.1 发酵时间对菌株产酶的影响
• 4.2.3.2 培养温度对菌株产酶的影响
• 4.2.3.3 培养基初始pH 值对菌株产酶的影响
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 菌体生长曲线
• 4.3.2 产酶条件研究
• 4.3.2.1 培养时间对产酶的影响
• 4.3.2.2 培养温度对菌株产酶的影响
• 4.3.2.3 培养基初始pH 值对菌株产酶的影响
• 4.4 小结
• 5 .诱变育种
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 仪器设备
• 5.1.4 实验试剂
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 孢子悬浮液制备
• 5.2.2 出发菌株紫外线诱变
• 5.2.3 亚硝基胍（NTG）诱变
• 5.2.4 紫外线和亚硝基胍复合处理
• 5.2.5 硫酸二乙酯（DES）诱变处理
• 5.2.6 紫外线和硫酸二乙酯复合处理
• 5.2.7 氯化锂处理
• 5.2.8 等离子体诱变
• 5.2.9 纤维素酶高产突变株的筛选
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 紫外诱变结果
• 5.3.2 亚硝基胍诱变结果
• 5.3.3 硫酸二乙酯诱变结果
• 5.3.4 氯化锂诱变结果
• 5.3.5 等离子体诱变结果
• 5.3.6 复合诱变纤维素酶高产突变株的筛选
• 5.3.7 小结
• 6. 纤维素酶高产突变株酶活提高的机理研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 菌株
• 6.1.2 培养基
• 6.1.3 仪器设备
• 6.1.4 试剂
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 纤维素酶高产突变株与出发菌株SDS-PAGE 分析
• 6.2.1.1 菌体总蛋白质的提取（TCA/丙酮法）
• 6.2.1.2 蛋白质样品的裂解
• 6.2.1.3 蛋白质定量测定
• 6.2.1.4 全菌蛋白SDS-PAGE
• 6.2.2 纤维素酶高产突变株与出发菌株RAPD 分析
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 蛋白质标准曲线
• 6.3.2 纤维素酶高产突变株与出发菌株差异蛋白质分析
• 6.3.3 纤维素酶高产突变株与出发菌株DNA 指纹比较分析
• 7 全文总结与展望
• 7.1 全文总结
• 7.2 本文存在的问题及深入的方向
• 参考文献
• 附录
• 致谢