论文摘要
中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）是我国重要的淡水养殖品种,近年来,随着其养殖规模的不断扩大和集约化程度的不断提高,由细菌、病毒和寄生虫等病原引起的各种病害日益严重,给中华绒螯蟹养殖业造成了巨大的损失。其中颤抖病是中华绒螯蟹中最为严重的病害,王文等的前期研究证明颤抖病的病原为一种特殊的细菌——螺原体,并正式命名为中华绒螯蟹螺原体（Spiroplasma eriocheiris）。中华绒螯蟹螺原体不仅可以感染属于无脊椎动物的中华绒螯蟹,还可以感染属于脊椎动物的鸡胚和新生小鼠,引起小鼠白内障病症,这与非凡螺原体（Spiroplasma mirum）可以引起啮齿类新生个体（包括新生小鼠）患白内障的病症非常相似。前期对中华绒螫蟹螺原体生理生化特性、分类地位、病原检测、敏感药物的筛选和有效治疗药物的药代动力学进行了研究,并且完成了全基因组的测序和注释,但是关于其在体外细胞水平上侵染无脊椎动物和脊椎动物宿主靶细胞的研究还未开展,而螺原体侵染靶细胞的模型建立是研究病原与宿主互作关系的基础,也是研究螺原体分子致病机制的前提。因此,本论文分别建立了中华绒螯蟹螺原体侵染脊椎动物小鼠3T6细胞模型和侵染无脊椎动物中华绒螯蟹血细胞模型,并用Far-western blot方法筛选到中华绒螯蟹血细胞宿主细胞上的受体相关蛋白Beta-Actin。这些工作为下一步研究中华绒螯蟹螺原体分子致病机制打下了坚实的基础。1.螺原体侵染3T6细胞模型的建立及病理学研究本论文选择已报道的对非凡螺原体（S. mirum）敏感的小鼠3T6细胞株,用中华绒螯蟹螺原体（S. eriocheiris）菌株BY-10体外侵染3T6细胞,建立细胞侵染模型。用免疫荧光技术在细胞水平定位了中华绒螯蟹螺原体分布,发现中华绒螯蟹螺原体主要以单个螺原体侵染进入细胞,同时还观察到螺原体进入3T6细胞一段时间后,形成被膜状结构所包裹的荧光团块。用透射电子显微镜进一步观察,显示这些荧光团块为螺原体进入细胞后大量增殖形成的包涵体,同时中华绒螯蟹螺原体的侵染还使3T6细胞产生空泡化的病理学特征。本文还建立了土霉素法定量评价螺原体侵染能力的技术,不仅可以定量评价螺原体侵染3T6细胞的过程,将来还可以用此法筛选螺原体的强毒株和弱毒株,以及用于评价螺原体侵染相关蛋白拮抗中华绒螯蟹螺原体侵染的能力。这些结果为以后在细胞水平研究中华绒螯蟹螺原体侵染脊椎动物细胞的机理奠定了基础。2.中华绒螯蟹血细胞侵染模型的建立及病理学研究血细胞是中华绒螯蟹免疫过程中的重要组织,也是中华绒螯蟹颤抖病发生过程中被病原首要攻击的目标,因此用血细胞作为研究中华绒螯蟹螺原体与宿主相互作用的致病机理是非常好的实验材料。为研究中华绒螯蟹螺原体与其宿主血细胞在细胞水平上的相互作用,尝试优化中华绒螯蟹血细胞原代培养技术。改良后培养体系为：抽取中华绒螯蟹的血淋巴与ACD-B抗凝剂混合,1000rpm 10min离心分离,培养条件为：改良L-15培养基（1 L配方干粉,15% FBS,葡萄糖1.5 g/L, NaCl 7.5 g/L,青霉素和链霉素均为100 U ml-1, pH 7.2-7.4）,无CO2,28℃培养。结果显示,此培养体系能有效地促进血细胞的生长,并且存活5-7天。培养的中华绒螯蟹血细胞可以分为三个亚群：大颗粒细胞（GC）、小颗粒细胞（SGC）以及透明细胞（HC）。用中华绒螯蟹螺原体（S. eriocheiris）菌株BY-10体外侵染中华绒螯蟹血细胞,结果显示,血细胞在36h内就发生细胞病变效应（CPE）,细胞由最初的放射状变为不规则团状。免疫荧光结果显示,在体外条件下侵染24 h后,标记上绿色荧光的螺原体在血细胞中主要侵染小颗粒细胞,并且呈现团状分布。通过透射电子显微镜观察,我们在细胞内观察到螺原体侵染过程中形成的包涵体,同时还观察到包涵体中的螺原体从破裂的细胞中释放出来。3. Far-Western Blot方法筛选宿主受体相关蛋白及其初步研究中华绒螯蟹螺原体侵染脊椎动物3T6细胞和中华绒螯蟹原代培养血细胞的侵染模型建立,为深入开展螺原体致病机理和与宿主互作蛋白的筛选奠定了基础。本实验中采用Far-Western Blot的方法,在体外筛选宿主细胞上的受体相关蛋白,结果显示大小约为42 kDa的蛋白与螺原体存在相互作用。通过串联质谱测定该蛋白条带的序列片段,并与数据库中的已知蛋白序列进行比对,该蛋白与凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）、日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）及淡水螯虾（Pacifastacus leniusculus）等的Beta-Actin有很高的相似性,可以肯定筛选到的宿主细胞受体相关蛋白为Beta-Actin蛋白。最后通过免疫荧光法标记螺原体和受体相关蛋白确定两者在细胞内的定位,结果显示带有绿色荧光标记的螺原体贴附在红色荧光标记的Actin蛋白上,根据相互位置分析可能为螺原体表面蛋白与Beta-Actin贴附。
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