Foxp3转染CD4+CD25-T细胞诱导大鼠同种异体心脏移植免疫耐受的研究

论文摘要

背景:心脏移植是治疗终未期心脏病的有效方法,但目前受体必须通过终身使用免疫抑制剂,降低受体的全身的免疫功能,减少或抑制对移植物的免疫排斥反应,从而达到维持移植心脏的功能。但长期使用免疫抑制剂易导致感染和肿瘤的高发,而且各种免疫抑制剂的其他毒副作用影响受体的生存质量。因此,如何诱导免疫耐受,摆脱免疫抑制依赖是目前移植领域面临的主要问题。近十年来的研究表明,调节性T细胞具有主动调控反应性T细胞而使机体产生免疫耐受的能力得到学者的广泛关注。但对于调节性T细胞诱导免疫耐受的机理尚不是十分清楚,且可应用的调节性T细胞的数量过少,而限制了其临床应用。本试验通过构建大鼠Foxp3基因,转染CD4+CD25-T细胞,研究CD4+CD25+调节性T细胞诱导免疫耐受的效果和机理。第一部分携带Foxp3基因慢病毒载体的构建目的:克隆Foxp3的cDNA,构建Foxp3-cDNA表达载体。方法:根据Genebank公布的大鼠Foxp3-cDNA的基因序列,用Trizol从大鼠胸腺中提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增Foxp3-cDNA基因,并将其克隆到载体pWPXL-MOD,构建Foxp3-cDNA表达载体,然后转染DH5α感受态细菌。选择阳性克隆菌,行双酶切鉴定和测序验证所获得的cDNA。用慢病毒包装的Foxp3-cDNA的穿梭质粒转染包装细胞293T细胞进行扩增后,使用由四质粒组成的慢病毒转染系统进行基因重组。结果:双酶切鉴定和测序验证所获得的cDNA为1900bp的Foxp3基因,序列测定结果与GenBank报道的完全一致。结论:使用RT-PCR法成功构建Foxp3-cDNA表达载体;构建Foxp3基因重组慢病毒。第二部分用携带目的基因的Foxp3慢病毒转染CD4+CD25-T细胞目的:用免疫磁珠分离CD4+CD25+T细胞及CD4+CD25-T细胞;使用携带目的基因Foxp3的慢病毒感染CD4+CD25-T细胞。方法:用免疫磁珠分离CD4+CD25+T细胞及CD4+CD25-T细胞,流式细胞仪鉴定分离细胞的纯度,在感染前24h通过添加抗CD3单抗及抗CD28单抗刺激细胞增殖。用携带Foxp3-cDNA的慢病毒,转染经免疫磁珠分离后扩增的CD4+CD25-T细胞,检测其荧光表达。提取蛋白后,行Western blot检测Foxp3蛋白的表达。结果:分离纯化的CD4+CD25+T细胞的纯度达95.2%,CD4+CD25-T细胞的纯度为99.1%。病毒感染的CD4+CD25-T细胞荧光显微镜下观察,感染率达80%。结论:成功地用免疫磁珠分离了CD4+CD25+T细胞及CD4+CD25-T细胞;用携带Foxp3的慢病毒能感染大鼠的CD4+CD25-T细胞,并表达Foxp3蛋白。第三部分转入Foxp3基因的CD4+CD25-T细胞免疫抑制功能的研究目的:体外检测转入Foxp3基因的CD4+CD25-T细胞免疫抑制功能。方法:流式细胞仪鉴定转入Foxp3基因的CD4+CD25-T细胞的CD25的表达率;通过混合淋巴细胞反应、增殖抑制试验及上清液中IL-10和IL-6的检测,推断转基因细胞的功能。结果:转入Foxp3基因的CD4+CD25-T细胞的CD25阳性表达率为80.2%,在体外单向淋巴细胞混合反应及增殖抑制试验中发现转入Foxp3基因的CD4+CD25-T细胞与CD4+CD25+T细胞具有相似的功能。结论:转入Foxp3基因的CD4+CD25-T细胞在体外具有抑制效应性T细胞的功能;其表面分子发生了变化,CD25呈阳性表达。第四部分同种异体大鼠异位心脏移植模型的建立目的:用改良Ono法进行同种异体大鼠腹腔异位心脏移植,建立动物模型。方法:以体重约为250g的Wistar大鼠为受体,体重为200-250g的SD大鼠为供体,进行大鼠腹部异位心脏移植手术。行供体的主动脉与受体的腹主动脉行端侧吻合,供体的肺动脉与受体的下腔静脉行端侧吻合。结果:大鼠腹腔异位心脏移植模型成功率达90.91%,总手术时间约49-71min。结论:以改良的Ono法进行大鼠腹部心脏移植,可靠易行,成功率高,但需要一定的显微外科基础。第五部分Foxp3基因转染的CD4+CD25-T细胞对同种异体心脏移植的作用及其机制目的:研究Foxp3基因转染的CD4+CD25-T细胞对同种异体心脏移植术后免疫耐受的影响及其机制。方法:64只Wistar大鼠为受体,分为四组,每组16只。第一组为空白对照组（术前注入PBS）,第二组为术前注入CD4+CD25+调节性T细胞组,第三组为术前一周每日用CsA灌胃,第四组为转入Foxp3基因CD4+CD25-T细胞组。移植术后每日三次腹部触诊1次观察移植心脏心跳的情况;7日后每组取8只大鼠,麻醉后开腹观察移植心脏的情况,同时采血5ml,取下脾脏及双侧腋下淋巴结;用ELISA法测定血清中的IL-6、IL-10、TGF-β1;用流式细胞仪测定脾脏及双侧腋下淋巴结的淋巴细胞CD4、CD8分子的表达。结果:移植的心脏第一组和第三组的生存时间明显低于第二组和第四组,第四组与第二组生存时间相比无明显差异;第一组外周血的IL-6显者高于其他组,第二、三、四组间比较无显著性差异;第一组外周血的IL-10显著低于其他组,第二、三、四组间比较无显著性差异;第二、四组外周血的TGF-β1显著高于第一、三组,第二、四组间比较无显著性差异。结论:转入Foxp3基因CD4+CD25-T细胞具有诱导移植免疫耐受功能与CD4+CD25+T细胞相比差异无显著性。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一部分 携带Foxp3 基因慢病毒载体的构建
• 一、实验材料
• 二、实验方法
• 三、结果
• 四、讨论
• 参考文献
• +CD25-T 细胞'> 第二部分 使用慢病毒系统包装 Foxp3 基因转染 CD4⁺CD25-T 细胞
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• +CD25^-T 细胞免疫抑制功能的研究'>第三部分 转入Foxp3 的CD4⁺CD25^-T 细胞免疫抑制功能的研究
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• 第四部分 大鼠同种异体心脏移植模型的建立
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• +CD25^-T 细胞对同种异体大鼠心脏移植的作用及其机制'>第五部分 Foxp3 基因转染的CD4⁺CD25^-T 细胞对同种异体大鼠心脏移植的作用及其机制
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 参考文献
• 结论
• 附录
• 英文缩略词表
• 攻读学位读期间公开发表论文
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 详细摘要