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重组IGFBP-4蛋白的表达、纯化、晶体生长及其对鹿茸细胞增殖抑制的研究

2020-11-29阅读(483)

重组IGFBP-4蛋白的表达、纯化、晶体生长及其对鹿茸细胞增殖抑制的研究

论文摘要

研究背景与目的:胰岛素样生长因子结合蛋白-4（insulin-like growth factor binding protein-4,IGFBP-4）作为一个重要的细胞因子,具有多种重要的生理功能。它既是构成动物GH/IGF生长轴的一个重要成员,同时又是一个重要的抗癌蛋白,对绝大多数体外培养肿瘤细胞具有抑制生长和促进细胞凋亡的作用。对IGFBP-4的研究受到越来越广泛的重视。鹿茸是一种神奇的名贵中药,不仅具有其独特的药用价值,而且具有重要的科学研究意义。在动物的进化过程中,脊椎动物逐渐失去了肢体附属器官再生的能力,但鹿茸角作为一种复杂的哺乳动物附属器官,却能每年从角柄上脱落和完全再生。而且鹿茸生长速度之快在哺乳动物组织生长中也是绝无仅有的。鹿茸角为我们研究哺乳动物组织器官的再生、创伤修复以及癌症发生等提供了理想模型。本研究通过克隆人IGFBP-4 cDNA、构建原核表达载体、并进行高效表达和纯化,利用基因工程技术来生产重组蛋白;利用纯化的重组IGFBP-4蛋白进行晶体生长,为进一步解析其三维结构、研究其结构与功能的关系奠定基础;利用体外细胞培养实验,研究其对鹿茸细胞增殖分裂及凋亡的影响,为进行鹿茸再生机理的深入研究开辟了新的途径。材料与方法:根据GenBank中人IGFBP-4成熟肽的cDNA序列,结合表达载体pGEX-6P-1的特点设计、合成一对特异性引物。采用PCR的方法扩增人成熟IGFBP-4蛋白cDNA片段,然后将其定向克隆到载体pGEX-6P-1中,构建原核表达重组载体pGEX-6p-1-BP4;重组载体转入大肠杆菌DH5α扩增、提取后,用PCR、限制性内切酶酶切以及DNA序列测定等方法进行鉴定。鉴定正确的阳性pGEX-6p-1-BP4重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,通过Amp抗性筛选获得稳定表达的阳性工程菌;以IPTG诱导工程菌高效表达重组蛋白IGFBP-4,利用GST亲合层析、琼脂糖凝胶层析对重组IGFBP4蛋白进行分离纯化,并进行Western blot检测;最后通过晶体生长和体外细胞培养实验对重组IGFBP4蛋白进行结构和功能的研究。实验结果:1、成功的构建了IGFBP-4 cDNA原核表达载体pGEX-6p-1-BP4;建立了稳定转化pGEX-6p-1-BP4重组质粒的大肠杆菌细胞株BL21-pGEX-6p-1-BP4,并使IGFBP-4cDNA在转化细胞内获得高效稳定表达。2、确立了工程菌以可溶性形式高效表达重组IGFBP4蛋白的培养条件。重组工程菌pGEX- IGFBP-4/ BL21（DE3）的最佳表达条件确定为:温度16℃、IPTG浓度为0.6mM、诱导时间为20小时。建立了高效纯化重组IGFBP4蛋白的工艺,较好地纯化出了IGFBP-4蛋白,蛋白质纯度达到97%以上,为以后进行IGFBP4蛋白结构和功能的研究创造了条件。3、本研究在生长温度为13℃,18%聚乙二醇8000,0.2mol/L醋酸钙,0.1M二甲胂酸钠,pH6.5条件下,成功地生长了重组IGFBP-4蛋白的晶体,并进行了晶体生长条件的优化,得到了可供蛋白质三维结构解析所需要的蛋白质晶体。4、首次发现IGFBP-4蛋白对鹿茸细胞的增殖抑制作用,为进一步研究其在鹿茸生长和再生中的作用、阐明GH/IGF轴的生长调控机理开辟了新的可能途径。结论:本研究利用基因工程技术成功的构建了IGFBP-4 cDNA原核表达载体,获得了稳定高效表达可溶性重组IGFBP-4的工程菌;经过GST亲合层析和琼脂糖凝胶过滤层析对重组IGFBP4蛋白进行分离纯化,获得了高纯度的有生物活性的目的蛋白;利用纯化的目的蛋白成功地生长出了可供三维结构解析的优良晶体,并证明了重组IGFBP-4对鹿茸细胞增殖具有抑制活性。为进一步深入研究IGFBP-4的结构与功能,研究鹿茸生长及再生的分子机理奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 绪论
  • 1.1 IGFS 研究进展
  • 1.1.1 胰岛素样生长因子-I
  • 1.1.2 胰岛素样生长因子-II
  • 1.2 胰岛素样生长因子受体
  • 1.3 胰岛素样生长因子结合蛋白
  • 1.3.1 IGFBP 超家族组成及性质
  • 1.3.2 IGFBP 的结构
  • 1.3.3 IGFBP 的分布与调节
  • 1.3.4 IGFBP 的功能
  • 1.4 IGFBP4 研究进展
  • 1.4.1 IGFBP-4 作用的主要方式及作用机理
  • 1.4.2 IGFBP-4 的生理作用
  • 1.4.3 IGFBP-4 基因的基因组结构
  • 1.4.4 IGFBP-4 基因的表达及调控
  • 1.4.5 IGFBP-4 蛋白结构与功能的关系
  • 1.4.6 IGFBP-4 水解酶
  • 1.5 本实验研究的目的与意义
  • 第二章 IGFBP-4 原核表达载体的构建及鉴定
  • 2.1 实验材料
  • 2.1.1 实验材料及试剂
  • 2.1.2 实验仪器
  • 2.1.3 主要溶液配制
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 化学合成目的基因片段
  • 2.2.2 目的基因的扩增
  • 2.2.3 质粒的提取
  • 2.2.4 感受态细胞的制备
  • 2.2.5 pGEX-6p-1 表达载体的构建
  • 2.2.6 连接产物的转化及重组子的筛选、鉴定
  • 2.3 实验结果
  • 2.3.1 目的基因 PCR 扩增结果
  • 2.3.2 重组质粒的鉴定
  • 2.4 讨论
  • 2.4.1 PCR 扩增目的基因的特异性
  • 2.4.2 目的基因 IGFBP4 的制备
  • 2.4.3 表达载体pGEX-6p-1 的选择
  • 2.4.4 pGEX-6p-1-BP4 表达重组体的构建和鉴定
  • 第三章 重组 IGFBP-4 基因在大肠杆菌中的表达与纯化
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 实验材料
  • 3.1.2 实验方法
  • 3.2 实验结果
  • 3.2.1 重组工程菌 BL21
  • 3.2.2 重组工程菌 BL21/BP4 的最佳表达条件的摸索
  • TM48 亲和层析结果'>3.2.3 GST-IGFBP4 融合蛋白 Glutathion SepharoseTM48 亲和层析结果
  • 3.2.4 凝胶层析（分子筛层析）和阴离子交换进一步纯化目的蛋白
  • 3.2.5 目的蛋白含量测定的结果
  • 3.2.6 重组 IGFBP4 目的蛋白免疫印迹鉴定结果
  • 3.3 讨论
  • 3.3.1 GST 亲和层析纯化目的蛋白
  • 3.3.2 重组蛋白纯化的总体策略
  • 3.3.3 蛋白纯度、得率及对目标蛋白的要求
  • 3.3.4 如何保持所纯化重组蛋白质的生物学活性
  • 3.3.5 如何保证蛋白质纯化的有效性
  • 3.3.6 分离纯化的基本原则
  • 3.3.7 可溶重组蛋白的分离纯化
  • 3.3.8 层析技术在分离纯化中的应用
  • 3.3.9 亲和标签在重组蛋白分离纯化中的应用
  • 3.3.10 选择亲和标签时需要考虑的因素
  • 第四章 重组 IGFBP-4 蛋白晶体生长研究
  • 4.1 材料与方法
  • 4.1.1 实验材料及试剂
  • 4.1.2 实验设计
  • 4.1.3 实验操作步骤
  • 4.2 结果
  • 4.3 讨论
  • 4.3.1 蛋白质结晶方法
  • 4.3.2 蛋白结晶过程分子间的相互作用
  • 4.3.3 影响蛋白质结晶的因素
  • 4.3.4 蛋白质结晶的复杂性
  • 4.3.5 IGFBP-4 蛋白结构与功能的关系
  • 第五章 重组 IGFBP-4 蛋白对鹿茸细胞增殖抑制的研究
  • 5.1 材料与方法
  • 5.1.1 材料与试剂
  • 5.1.2 实验方法
  • 5.2 实验结果
  • 5.2.1 倒置相差显微镜观察细胞基本形态学的变化
  • 5.2.2 IGFBP-4 对鹿茸细胞增殖的抑制作用
  • 5.3 讨论
  • 5.3.1 IGFBP-4 对细胞增殖的抑制
  • 5.3.2 原核系统进行真核基因表达的产物活性
  • 5.3.3 鹿茸细胞的选择
  • 5.3.4 台盼蓝染色法的选择
  • 第六章 全文结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历

    • 相关论文文献

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