结核分枝杆菌抗原及其融合蛋白在大肠杆菌、烟草中表达和免疫效应研究

论文摘要

结核病是世界性的社会经济问题,尤其是在发展中国家,严重威胁人类的生命健康。据世界卫生组织（World Health Organization, WHO）报道,目前全世界超过三分之一的人口已感染结核菌,每年有近900万新发病例,300万人死于结核病。疫苗是预防和控制结核病的最佳途径,但目前国内外临床应用的只有卡介苗一种,且其预防效果存在较大争议,急需研制新型有效的结核疫苗。早期、快速、准确诊断对于结核病的防治至关重要,临床上尚缺乏特异、敏感的诊断方法,血清免疫学检查比其他实验室方法具有固有优势。基于结核分枝杆菌特异性抗原的融合蛋白是目前研究与开发结核疫苗、诊断方法及制剂的主要方向之一。国内外最新研究表明,Ag85B、ESAT-6抗原蛋白可作为研发结核疫苗、诊断制剂的理想靶抗原。WbbL为结核分枝杆菌特有的胞外功能蛋白,序列结构保守,种属特异性高,存在潜在抗原表位,很可能作为分枝杆菌感染的特异性分子标志。转基因植物作为生物反应器生产口服疫苗、诊断制剂为医用结核疫苗、诊断新方法的研发提供了新途径。本研究首先克隆结核分枝杆菌rfbpB、esxA和rwbbLJ基因,获得rfbpB-esxA、 rfbpB-esxA-rwbbL1融合抗原编码基因；通过原核表达载体pET-30a,马铃薯X病毒载体pgR107、植物二元载体pBI121介导其在大肠杆菌及烟草叶片中进行表达,获得特异的抗原蛋白；体内、体外观察评价所得到的纯化蛋白的免疫原性及保护效果,阐明各种抗原物质的临床诊断价值、疫苗应用前景及免疫应答机制。主要研究结果如下：1)对结核分枝杆菌wbbLl基因及rfbpB-esxA融合基因的生物信息学分析结果表明,wbbLl基因编码鼠李糖基转移酶（Rhamnosyl Transferase, WbbL）;该蛋白位于细胞外,二级结构以α螺旋为主,含有一个糖基转移酶的结构域,存在6个潜在抗原表位且有很好的抗原物质潜力；蛋白序列、结构保守,为结核分枝杆菌所特有。WbbL蛋白很可能是理想的结核免疫诊断方法、疫苗及抗结核药物的靶分子。疏水性接头（Gly4Ser）3的引入不会改变Ag85B、ESAT-6蛋白的抗原性。2)应用PCR、SOE-PCR技术克隆获得了rfbpB、esxA、rwbbL1基因及rfbpB-esxA及rfbpB-esxA-rwbbLl融合基因,通过基因工程技术,构建了携带各单基因及融合基因的原核表达载体,PCR、酶切鉴定及测序表明构建成功。IPTG作为诱导剂诱导蛋白表达,SDS-PAGE分析表明在大肠杆菌中表达出了Ag85B、ESAT-6、WbbL Ag85B-ESAT-6及Ag85B-ESAT-6-WbbL蛋白,但大部分以包涵体的形式存在。通过诱导条件的优化,获得了可溶蛋白组分,其中ESAT-6、WbbL及Ag85B-ESAT-6-WbbL蛋白的优化效果较好。采用亲和层析方法获得了纯化蛋白,Western blotting鉴定表明各种表达蛋白与His-tag形成了融合蛋白,表达正确。3)应用PCR技术对基因结构进行改造,获得了适合植物表达的各单基因及融合基因,然后将其构建于PVX载体pgR107及植物二元载体pBI121上, PCR、酶切鉴定及测序表明构建成功。通过植物转基因技术,叶片注射法侵染烟草,在侵染液OD600介于0.8-1.0之间时,侵染效果最佳。通过pgR107-GFP所携带的绿色荧光蛋白及pBL121所携带的GUS检测确定了外源蛋白的最高表达时间阶段,其中PVX载体在第7天时表达量最高,pBI121系列载体为侵染后的第2天。提取叶片总蛋白SDS-PAGE分析表明Ag85B、ESAT-6、WbbL及Ag85B-ESAT-6蛋白在烟草中获得了表达,获得了纯化蛋白。Western blotting鉴定表明蛋白表达正确。4)以大肠杆菌、烟草中表达的各种纯化蛋白为抗原,建立以结核患者血清为一抗的ELISA检测方法,评价观察表明各种蛋白诊断特异性较好（均超过90%）,敏感性差别较大,融合蛋白好于单一抗原蛋白,从高到低依次为Ag85B-ESAT-6-WbbL、Ag85B-ESAT-6、ESAT-6、Ag85B及WbbL。由于WbbL蛋白在结核感染全程表达,可能更适合应用于其中、后期的诊断。初次免疫-加强免疫策略免疫小鼠动物实验结果表明,各蛋白均有良好的免疫原性,可激发产生以Thl型为主的细胞免疫应答,原核表达及植物表达的蛋白免疫效果几乎一致。与NS对照组相比,激发小鼠产生的血清特异IgG、IFN-γ及IL-2水平显著升高,差异均有统计学意义（P<0.05）。本研究将为研制和开发新型的人畜共用结核疫苗、临床诊断试剂提供了新思路、新材料并奠定了一定的理论基础,对防治结核病具有较大的临床意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 结核病疫情及我国防治现状
• 1.2 结核疫苗的研究
• 1.3 结核诊断方法的研究
• 1.4 转基因植物生物反应器的研究
• 1.5 转基因植物结核疫苗及诊断制剂的研究
• 1.6 本研究的目的和意义
• 1.7 研究技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 材料、试剂与仪器
• 2.1.1 基因组、菌株与质粒
• 2.1.2 植物材料
• 2.1.3 实验动物及血清
• 2.1.4 工具酶
• 2.1.5 主要试剂
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 结核分枝杆菌wbbL1基因及rfbpB-esxA融合基因的生物信息学分析
• 2.2.2 结核分枝杆菌rfbpB、esxA、rwbbL1基因及rfbpB-esxA、rfbpB-esxA-rwbbL1融合基因原核表达载体的构建
• 2.2.3 结核分枝杆菌rfbpB、esxA、rwbbL1基因及rfbpB-esxA、rfbpB-esxA-rwbbL1融合基因植物表达载体的构建
• 2.2.4 结核分枝杆菌rfbpB、esxA、rwbbL1基因及rfbpB-esxA、rfbpB-esxA-rwbbL1融合基因在E.coli中的表达、纯化和鉴定
• 2.2.5 结核分枝杆菌rfbpB、esxA、rwbbL1基因及rfbpB-esxA、rfbpB-esxA-rwbbL1融合基因在烟草中的表达、纯化和鉴定
• 2.2.6 E.coli、烟草中表达蛋白的免疫原性分析
• 3 结果与分析
• 3.1 生物信息学分析结果
• 3.1.1 wbbL1基因及其编码蛋白质的生物信息学分析、预测结果
• 3.1.2 rfbpB-esxA融合基因及其编码蛋白质的生物信息学分析、预测结果
• 3.2 原核表达载体的构建结果
• 3.2.1 结核分枝杆菌rfbpB、esxA及rwbbL1基因的扩增
• 3.2.2 结核分枝杆菌rfbpB-esxA、rfbpB-esxA-rwbbL1融合基因的扩增
• 3.2.3 结结核分枝杆菌rfbpB、esxA、rwbbL1基因及rfbpB-esxA、rfbpB-esxA-rwbbL1融合基因与原核表达载体pET-30a的连接
• 3.3 植物表达载体的构建结果
• 3.3.1 结核分枝杆菌rfbpB、esxA、rwbbL1基因及rfbpB-esxA、rfbpB-esxA-rwbbL1融合基因的扩增
• 3.3.2 结结核分枝杆菌rfbpB、esxA、rwbbL1基因及rfbpB-esxA、rfbpB-esxA-rwbbL1融合基因与植物表达载体的连接
• 3.4 E.coli中表达的结果
• 3.4.1 优化诱导前外源蛋白的表达情况及分析
• 3.4.2 优化诱导后外源蛋白的表达情况及分析
• 3.4.3 外源蛋白的纯化与Western blotting分析
• 3.5 烟草中表达的结果
• 3.5.1 报告基因GFP、GUS的检测结果与分析
• 3.5.2 植物表达蛋白的分析与鉴定
• 3.6 E.coli、烟草中表达蛋白免疫原性的分析
• 3.6.1 血清诊断学评价结果
• 3.6.2 动物免疫效果评价分析
• 4 讨论与结论
• 4.1 讨论
• 4.1.1 生物信息学
• 4.1.2 原核表达载体的构建及在E.coli中表达
• 4.1.3 植物表达载体的构建及在烟草中表达
• 4.1.4 表达蛋白免疫原性
• 4.2 结论
• 参考文献
• 致谢