TLR4启动子遗传变异及环境因素交互与复发性流产易感性

论文摘要

不明原因复发性流产（Unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA）至今机制不明。Toll样受体家族（Toll like receptors,TLRs）参与了母胎界面的天然免疫及获得性免疫,在妊娠免疫耐受中发挥关键作用。TLR4是目前TLRs中研究最为深入的一种,研究重心集中在感染及免疫领域。本课题实验研究表明,TLR4与人类母胎界面细胞信息传递及免疫耐受有关。TLR4在人早孕蜕膜的表达上调及下调与自然流产或胚胎停育相关。关于环境因素对复发性流产发病的报道,西方国家有不断增加趋势,而国内未见报道。本研究同时建立了Logistic回归模型,纳入家族史、体重指数（Body mass index, BMI）、吸烟史、被动吸烟史（Environmental tobacco smoking, ETS）、饮酒史、饮咖啡史等与自然流产发病相关因素,从而找出有独立危险的环境病因。生物遗传学信息表明,TLR4启动子区域存在单核苷酸变异。按照碱基在人群中分布不少于5%的原则,我们发现TLR4启动子区域2个变异频率较高的等位基因变异,即rs10983755及ss77136219存在单核苷酸的A/G变异,本课题将URSA组及对照组患者进行基因型测序,比较不同组的等位基因频率差异。同时,本课题将TLR4启动子区遗传变异及环境因素交互作用进行了Logistic多元回归分析,发现了交互作用与复发性流产发病的关联。本课题实验还证实了TLR4-ss77136219基因变异导致了TLR4-mRNA及密码子表达的差异。和许多疾病一样,“免疫平衡+遗传变异+环境因素+其他”导致疾病发生,URSA也不例外。本课题欲从以上几个方面,研究我国南方地区,女性URSA的发病病因。第一部分：TLR4在胚胎停育蜕膜组织中的表达-及其意义目的：研究TLR4在人早孕及胚胎停育蜕膜组织中的表达差异。方法：选取64例早孕妇女作为研究对象,选取健康早孕人流32例为对照组（A组）,胚胎停育（稽留流产）32例,分别留取其宫蜕膜组织。根据其HE病理切片,将胚胎停育者再分成炎症组（B组）及退变组（C组）各16例,应用免疫组化（immunohistochemistry, IHC）及免疫印记（Western-Blot, WB）检测TLR4蛋白在蜕膜组织中的表达差异。结果：TLR4在三组绒毛的合体滋养细胞、细胞滋养细胞、毛细血管内皮细胞的胞浆,蜕膜的蜕膜细胞呈不同程度的阳性染色。胚胎停育炎症组的蜕膜组织TLR4表达高于早孕对照组,退变组蜕膜组织TLR4表达低于正常组。结论：TLR4表达在稽留流产具重要作用,母体宫蜕膜组织TLR4蛋白对早孕母胎免疫平衡起重要作用。第二部分：南方女性不明原因复发性流产环境病因探讨目的：分析南方女性不明原因复发性流产（URSA）环境流行病学因素。方法：对326例URSA及400例正常对照育龄妇女进行健康调查问卷,用Logistic回归模型,纳入体重指数（BMI）、自然流产家族史、吸烟史、被动吸烟史、饮酒史、饮咖啡史,找出有独立意义的环境危险因素,并对自然流产次数进行3次及≥4次进行分层分析。结果：吸烟史、饮酒史和饮咖啡史不是URSA的危险因素,短时间被动吸烟（<1h/天）及长时间被动吸烟（≥1 h/天）是URSA的危险因素,OR及95%CI分别是（2.30,1.50-3.52；4.76,3.24-6.99）。家族史及BMI≥24.0 kg/m2是URSA危险因素,OR及95%CI分别是（2.12,1.28-3.49；1.55,1.12-2.14）。结论：被动吸烟史、BMI≥24.0 kg/m2、自然流产家族史是中国南方女性URSA独立危险因素。第三部分：南方女性TLR4启动子区SNP发生频率分析目的：分析240例对照组病例外周血的TLR4启动子区rs10983755及ss77136219这二个位点的SNP是否符合哈-温平衡及连锁不平衡。方法：取250例DNA进行TLR4启动子区rs10983755及ss77136219二个位点进行SNP的基因分型,各个病例间无血缘关系,取提取DNA并成功分型的240例,进行Hardy-Weinberg平衡分析及连锁不平衡分析。结果：研究群体符合Hardy-Weinberg平衡,两研究位点处于不完全连锁不平衡。结论：研究群体具有群体代表性,所研究的二个位点对于RSA的效应相互独立。第四部分：TLR4启动子区SNP与南方女性RSA发病易感性目的：TLR4启动子区rs10983755及ss77136219这二个位点A→G多态性变异与南方女性URSA易感性是否相关。方法：将240例健康对照组与183例RSA患者外周血进行DNA的基因分型,比较不同基因型在病例组与对照组间的发生频率的差别。结果：TLR4-rs10983755位点SNP与RSA发病无关；TLR4--ss77136219位点GG基因型在RSA组发生率显著增加。结论：TLR4-ss77136219-GG基因型为RSA的致病基因型,AA则为RSA的保护性基因型。第五部分：TLR4启动子区SNP及环境因素交互与南方女性RSA发病易感性目的：TLR4启动子区rs10983755及ss77136219这二个位点A/G多态性变异及环境因素交互与南方女性URSA易感性是否相关。方法：将240例健康对照组与183例RSA患者外周血进行DNA的基因分型,比较不同基因型及环境因素交互与RSA发病的关系。结果：TLR4-ss77136219位点A→G变异与年龄大于30岁之间存在着交互作用。结论：TLR4-ss77136219位点的GG及GA基因型与年龄大于30岁之间存在协同作用,RSA是一种基因-环境多因素交互的复杂性疾病。第六部分：TLR4启动子区SNP对TLR4基因转录及蛋白翻译的影响目的：TLR4启动子区ss77136219位点A→G多态性对TLR4基因调节的影响。方法：将RSA患者进行外周血ss77136219位点进行GG/GA/AA分型,用real-time PCR方法比较不同基因型TLR4—mRNA表达及用western-blotting比较不同基因型TLR4蛋白表达的差别。结果：GA与GG基因型组TLR4—mRNA及蛋白表达较从基因型组升高。结论：TLR4-ss77136219位点的A→G变异上调TLR4表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 参考文献
• 第一部分: 胚胎停育蜕膜组织中的TLR4表达及其意义
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 附图
• 参考文献
• 第二部分: 南方女性RSA环境流行病学病因探讨
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三部分: 南方女性TLR4启动子区域SNP发生频率分析
• 1 材料
• 2 方法
• 3. 结果
• 4 讨论
• 附图
• 参考文献
• 第四部分: TLR4启动子区rs10983755及ss77136219遗传变异与南方女性RSA易感性
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 附图
• 参考文献
• 第五部分: TLR4启动子区rs10983755及ss77136219遗传变异及环境因素交互与RSA易感性关系
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第六部分 TLR4基因启动子区SNP对TLR4基因转录及蛋白翻译的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 附图
• 参考文献
• 今后研究展望
• 全文结论
• 英文缩略词表
• 致谢
• 附录
• 综述（一）女性遗传及环境因素在复发性流产中的作用
• 参考文献
• 综述（二）TOLL样受体与女性生殖异常相关性研究
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文