拟南芥耐盐基因AtNHX5的大豆遗传转化研究

论文摘要

大豆是世界上重要的粮食和油料作物,但受环境等因素的影响,大豆的产量和品质受到一定制约。在我国由于干旱面积、盐碱地和次生盐碱化耕地的面积逐年增加,可耕种面积逐渐减少,严重制约着我国农作物的生产。因此,抗逆新品种的培育成为近年来的研究热点和重点。利用农杆菌介导法将抗逆基因转入大豆,为培育大豆抗逆新品种开辟了新途径。本研究以河北省优质大豆品种为材料,利用胚尖法以及整体子叶节法进行了拟南芥耐盐基因AtNHX5（CPA1家族的拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白基因）的遗传转化。获得主要结果如下:1、通过形态学方法初步确定了河北省优质大豆品种冀豆17号、五星2号、nf 58和冀黄13号的潮霉素敏感性,为转化植株的筛选确定适宜浓度。结果表明五星2号和冀豆17号的潮霉素筛选终浓度为10 mg/L,冀黄13号与nf58的筛选终浓度为8 mg/L。2、以五星2号成熟大豆胚尖为材料,利用超声波辅助农杆菌转化法优化了大豆胚尖转化体系。侵染阶段对胚尖进行两次80 W的超声波处理,每次20 s,与对照相比超声波处理明显提高了转化效率。在此基础上,以五星2号、五星3号、冀豆15号、冀豆16号和冀黄13号胚尖为外植体,利用超声波辅助农杆菌介导法进行了拟南芥耐盐基因AtNHX5的遗传转化。对五星2号再生植株在开花期进行PCR验证,初步证明AtNHX5基因已整合到五星2号基因组,转化率为0.16 %。3、利用新型整体子叶节法进行了AtNHX5基因转化研究。以带有一片子叶的胚轴为外植体,以带Basta筛选标记以及AtNHX5基因的pCAMBIA3301载体质粒进行转化,再生植株经PCR方法验证,初步证明AtNHX5基因已整合到五星2号基因组,转化率为1.47 %。该方法省去了外植体转化后繁琐、耗时的组织培养步骤,再生周期明显缩短,为农杆菌介导的大豆遗传转化提供了有力的技术平台。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 农杆菌介导的AtNHX5 大豆胚尖的遗传转化
• 1 引言
• 2 材料方法
• 2.1 供试材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 细菌和质粒
• 2.1.3 试验过程中使用的培养基
• 2.2 胚尖转化过程
• 2.2.1 种子消毒
• 2.2.2 组织培养过程
• 2.2.3 农杆菌的培养
• 2.2.4 侵染和共培养
• 2.2.5 恢复培养
• 2.2.6 转化芽的筛选和植株再生
• 2.3 超声波辅助农杆菌介导的遗传转化条件的摸索
• 2.3.1 超声波时间对农杆菌转化的影响
• 2.3.2 超声波次数对农杆菌转化的影响
• 2.3.3 不同基因型对农杆菌转化的影响
• 2.4 转AtNHX5 基因的植株PCR 检测
• 2.4.1 大豆基因组的提取方法
• 2.4.2 Hpt 基因PCR 检测反应体系
• 3 结果与分析
• 3.1 不同大豆品种潮霉素筛选终浓度的确定
• 3.2 不同超声波时间对农杆菌转化的影响
• 3.3 不同超声波次数对农杆菌转化的影响
• 3.4 不同基因型对农杆菌转化的影响
• 3.5 转AtNHX5 基因的植株PCR 检测
• 4 讨论
• 5 结论
• 第二部分 农杆菌介导的AtNHX5 大豆活体子叶节的遗传转化
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 AtNHX5 基因整合到双元载体为pCAMBIA3301
• 2.1.1 菌株、酶、质粒、试剂
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 E.coli 感受态细胞的制备和转化
• 2.1.4 农杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.1.5 质粒的提取
• 2.1.6 AtNHX5 基因的克隆测序
• 2.1.7 载体构建过程
• 2.2 大豆的遗传转化
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 种子消毒
• 2.2.3 外植体的获得
• 2.2.4 农杆菌的培养
• 2.2.5 侵染和共培养
• 2.2.6 移栽
• 2.2.7 转化植株的筛选
• 2.2.8 转化植株的PCR 验证
• 3 结果与分析
• 3.1 目的片断的克隆与测序
• 3.2 目的片断的连接及验证
• 3.3 农杆菌转化及验证
• 3.4 转化植株的筛选
• 3.5 转化植株的PCR 鉴定
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简介
• 致谢