rAAV8载体介导HIF-1α基因靶向治疗心肌缺血的体外研究

论文摘要

目的：构建含有MHC心肌特异性肌钙蛋白启动子和缺氧诱导因子-lα（HIF-1α）基因的重组腺相关病毒载体的包装质粒（pAAV-MHC-TnT-HIF-1α）,并包装6型和8型重组腺相关病毒,体外转导培养原代心肌细胞,观察其在心肌细胞的基因表达。方法：1、pAAV-MHC-TnT-HIFla质粒构建以现有质粒pEMBL-CMV-GFP为模板,用PCR合成含有酶切位点的GFP基因片段,酶切GFP片段及现有质粒pAAV-MHC-TnT-LacZ,连接构建成质粒pAAV-MHC-TnT-GFP,再酶切质粒pAAV-MHC-TnT-GFP及包含有HIFla基因的质粒pGEM-HIFla,连接得到重组质粒pAAV-MHC-TnT-HIFla。2、MHC-TnT启动子和HIF-1α基因表达活性的验证将pAAV-MHC-TnT-GFP转染293细胞,48h后在荧光显微镜下观察GFP的表达；pAAV-MHC-TnT-HIFla转染293细胞,Western Blot检测HIF-1α的表达。3、rAAV-MHC-TnT-HIF-1α病毒的包装将pAAV-MHC-TnT-HIF-1α,及辅助质粒pHelper,含Rep、Cap基因的pAAV8或pAAV6质粒,用三质粒共转染的方法转染293细胞,纯化病毒后用Dot-blot法检测病毒滴度,SDS-PAGE检测病毒纯度。4、rAAV6-MHC-TnT-HIF-1α表达检测将rAAV6-MHC-TnT-HIF-1α病毒感染原代心肌细胞48小时后,收集细胞,用Western Blot检测HIF-1α的表达。结果：1、成功构建了pAAV-MHC-TnT-HIF1a包装质粒。2、pAAV-MHC-TnT-GFP、pAAV-MHC-TnT-HIFla在293细胞中表达正常。3、成功的包装了rAAV8-MHC-TnT-HIFla和rAAV6-MHC-TnT-HIFla两种病毒,病毒滴度不低于1012vg/ml。4、rAAV6-MHC-TnT-HIFla病毒能在原代心肌细胞中表达。结论：1、成功构建了含有MHC心肌特异性肌钙蛋白启动子和缺氧诱导因子-lα（HIF-1α）基因的重组腺相关病毒载体的包装质粒（pAAV-MHC-TnT-HIFla）。2、成功包装了rAAV6-MHC-TnT-HIFla和rAAV8-MHC-TnT-HIFla 2种重组腺相关病毒；rAAV6-MHC-TnT-HIFla病毒在原代培养心肌细胞中能正常表达,rAAV8-MHC-TnT-HIFla病毒虽在293细胞中表达较低,但大量文献报道AAV8载体能介导治疗基因在小鼠心脏中高效表达,我们制备的rAAV8-MHC-TnT-HIFla载体为进一步在实验动物中研究其促血管新生作用打下了坚实的基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 技术路线图
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要药品和试剂
• 1.1.2 主要酶类
• 1.1.3 主要质粒、细菌、细胞、实验动物
• 1.1.4 主要实验仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 重组质粒pAAV2.1-MHC-TnT-HIF1a的构建路线图
• 1.2.2 试剂的配制
• 1.2.3 DH-5a电转化菌的制备
• 1.2.4 质粒DNA的转化
• 1.2.5 碱裂解法小量提取质粒DNA
• 1.2.6 重组pAAV-MHC-TnT-GFP质粒的构建
• 1.2.7 重组pAAV-MHC-TnT-HIF1a质粒的构建
• 1.2.8 质粒pEMBL-D（+）-CMV-GFP、pAAV9、pAAV8、pAAV6、pAAV2和pHelper的酶切鉴定
• 1.2.9 超速离心法大量提取质粒DNA
• 1.2.10 293细胞的培养
• 1.2.11 原代心肌细胞的培养
• 1.2.12 质粒pAAV-MHC-TnT-GFP、pEMBL-D（+）-CMV-GFP、pAAV-MHC-TnT-HIF1a转染293细胞
• 1.2.13 6型和8型重组腺相关病毒的包装
• 1.2.14 病毒的收获与纯化
• 1.2.15 SDS-PAGE法分析rAAV6-MHC-TnT-HIF1a、rAAV8-MHC-TnT-HIF1a的纯度
• 1.2.16 病毒滴度的测定
• 1.2.17 rAAV6-MHC-TnT-HIF1a、rAAV8-MHC-TnT-HIF1a转导体外培养细胞、Western Blot检测HIF-1a的检测表达
• 2、结果
• 2.1 PCR产物GFP及质粒pAAV-MHC-TnT-Lacznls的酶切
• 2.2 重组pAAV-MHC-TnT-GFP质粒酶切鉴定
• 2.3 重组pAAV-MHC-TnT-GFP质粒测序结果
• 2.4 质粒pAAV-MHC-TnT-GFP及pGEM-HIF1a酶切
• 2.5 重组pAAV-MHC-TnT-HIF1a质粒酶切鉴定
• 2.6 重组pAAV-MHC-TnT-HIF1a质粒测序结果
• 2.7 大提质粒pEMBL-D（+）-CMV-GFP、AAV9、pXX8、XX6、AAV2和pHelper的电泳
• 2.8 质粒pEMBL-D（+）-CMV-GFP、pAAV9、pAAV8、pAAV6、pAAV2和pHelper酶切鉴定
• 2.9 心肌细胞的分离培养结果
• 2.10 荧光显微镜检测pAAV-MHC-TnT-GFP的GFP表达
• 2.11 SDS-PAGE分析rAAV6-MHC-TnT-HIF1a、rAAV8-MHC-TnT-HIF1a的纯度
• 2.12 rAAV病毒滴度测定
• 2.13 rAAV6/rAAV8病毒的电镜分析
• 2.14 Western Blot检测HIF-1a的表达
• 3、讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 主要缩写词表
• 在读期间发表的主要学术论文及参与课题
• 附图
• 致谢