导读:本文包含了瑞氏木霉论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:纤维素酶基因,Trichoderma,reesei,瑞氏木霉
瑞氏木霉论文文献综述
郑芳林,吕新星,王磊,曹艳丽,陈冠军[1]（2015）在《瑞氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶基因转录调控辅因子的鉴定和功能研究》一文中研究指出丝状真菌瑞氏木霉(Trichoderma reesei)是目前工业产纤维素酶最主要的菌株,在纤维素、乳糖等碳源诱导下能分泌大量的纤维素酶。研究表明,转录因子Xyr1是调控其纤维素酶基因表达最重要的转录激活因子,该因子的缺失会导致几乎所有的纤维素酶基因无法转录表达,但其详细的作用机制至今仍不清楚。为了阐述Xyr1调控纤维素酶基因的作用机制,本研究前期利用酵母双杂交筛选系统获得了多个未被报道的Xyr1相互(本文来源于《第五届泛环渤海生物化学与分子生物学会学术交流会论文集》期刊2015-08-19）
陈小玲,龙思宇,陈英,张穗生,陈东[2]（2015）在《瑞氏木霉纤维素酶研究进展》一文中研究指出瑞氏木霉(Trichoderma reesei)产生的纤维素酶酶系全、能分泌到细胞外,是研究得最清楚的产纤维素酶的模式菌株,但是其产生的纤维素酶还不能满足工业化转化纤维素的需要。本文从纤维素酶种类与调控、提高纤维素酶活的方法、标记基因的选择等方面概述瑞氏木霉纤维素酶,分析瑞氏木霉纤维酶研究面临的问题及对策,指出提高β?葡萄糖苷酶的产量和酶活是未来研究工作的重点之一。(本文来源于《广西科学院学报》期刊2015年02期）
张庆[3]（2015）在《瑞氏木霉纤维素酶降解模式及其功能多样性研究》一文中研究指出随着全球经济的发展,化石资源迅速地被消耗,能源、资源、环境问题已经成为制约人类社会经济和生态可持续发展的主要瓶颈。纤维素是植物细胞壁的主要组成成分,是地球上最丰富的可再生碳源。纤维素的充分利用能够以可持续的方式缓解化石能源过度利用带来的环境危机。但是由于纤维素生物降解的生产成本过高,限制了资源的有效利用。为有效利用纤维素资源,构建高效纤维素降解酶系一直为研究的重点。目前普遍的观点认为纤维素酶系构成应主要由糖苷水解酶系、氧化酶系及辅助降解因子等组成。相对于外切纤维素酶及p-葡萄糖苷酶较为清晰的功能定位,酶系中往往存在多种内切纤维素酶,其功能与作用模式并没有得到很好的区分。同时,由于纤维素酶活测定使用底物衍生物和类似物并不能够全面反映酶系的活力,更不能确切反映纤维素酶系中各组分的角色与功能。因此,本文针对以上问题进行了较系统的研究,取得主要研究结果如下：1、通过对瑞氏木霉在14种不同碳源上糖苷水解酶的动态表达分析,发现瑞氏木霉纤维素酶系不同组分的表达分泌具有底物差异性。说明不同内切纤维素酶组分具有生理功能的差异性。对瑞氏木霉进行不同碳源下的分批培养,测定了其胞外外切纤维素酶、内切纤维素酶和木聚糖酶活性,并对培养基中还原糖的变化和寡糖的主要成分进行了时间进程的连续跟踪分析。研究发现,高聚合度寡糖的诱导能力要大于单糖的诱导能力。在不同碳源条件下,内切纤维素酶的分泌时间及组分种类显示明显的不同。这说明瑞氏木霉会根据胞外碳源的变化调整内切纤维素酶的分泌,印证了同一微生物分泌的内切纤维素酶应具有不同的功能。进一步选取叁种代表性的天然碳源(秸秆+麸皮、RAC、木聚糖)条件下发酵第五天的胞外蛋白质组进行了胞外蛋白质组的系统分析。结果显示叁种碳源条件下的蛋白组成成分各不相同,相差较大。RAC主要诱导降解纤维素的酶类；木聚糖为碳源的条件下,主要诱导降解半纤维素的酶类大量分泌,降解纤维素的酶类分泌量很少。由于秸秆和麸皮成分较为复杂,因此降解所需的纤维素酶,半纤维素酶都高效分泌。同时叁种碳源条件下,内切纤维素酶表达的种类及其表达量都有明显的差别,这说明不同内切纤维素酶组分具有生理功能的差异性。该研究结果对于以瑞氏木霉酶系为主的高效纤维素降解酶系的复配具有指导意义。2、建立了利用荧光辅助糖电泳(FACE)定量表征纤维素酶水解模式的方法,首次发现不同内切纤维素酶组分的作用模式存在显着差异。FACE技术是一种灵敏简单并且相对高通量的糖分析技术。在本研究中,我们将该技术用于纤维素酶的活性分析,通过对FACE图谱定量的方法,实现了对纤维素酶水解过程中产生的纤维寡糖种类以及每种寡糖含量的随时间过程的检测和定量分析,克服了常规以终点还原端总量反应纤维素酶活性方法的不足。研究发现,应用该FACE技术可以快速区分纤维素酶系中的外切纤维素酶(CBH)、内切纤维素酶(EG)和p-葡萄糖苷酶(BG)等酶组分的类别,实现了纤维素酶种类与降解模式的快速确定。通过对不同内切纤维素酶在水解无定形纤维素(RAC)的产物谱的定量分析,首次确认了不同内切纤维素酶的作用模式存在明显差异。即使同一糖苷水解酶家族(GH5)中,不同酶组分也有不同的降解模式。这一结果对于解释纤维素降解微生物为什么能够产生多组分内切纤维素酶提供了一个直接的证据。同时该研究结果说明仅仅基于序列一致性对糖苷水解酶进行分类可能是不够的,不能充分说明不同糖苷水解酶功能上的差别。基于FACE技术表征不同纤维素酶降解模式的分析,可以为糖苷水解酶的功能分类,特别是内切纤维素酶功能的进一步分类及功能分析提供一个新的有力工具。3、通过对瑞氏木霉4种内切纤维素酶的动态寡糖产物谱及其对活性中心生物信息学的分析,发现不同降解模式的内切纤维素酶有其特定的分子结构基础。对瑞氏木霉的EGⅠ、EGⅡ、 EGⅢ、EGⅣ四种内切纤维素酶组分水解无定形纤维素和纤维寡糖的产物谱进行了系统分析。结果表明不同内切纤维素酶组分并非传统上认为的随机结合并切断无定型纤维素链,而是与外切纤维素酶相似,特定的内切纤维素酶具有特征性产物谱。通过对这些酶组分对纤维寡糖水解的比较分析,发现每种内切纤维素酶的最小寡糖的结合单元是不同的：EG Ⅰ具有强的结合纤维叁糖并降解的能力；EGⅡ可以结合并降解纤维叁糖,但能力较EG Ⅰ弱；EGⅢ具有结合并降解纤维四糖的能力,EGⅣ具有结合并降解纤维五糖的能力。利用结构生物信息学分析技术,对具有结晶结构的叁种内切纤维素酶(EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ)进行了比较分析。通过生物信息学与结构生物学分析发现,叁种内切纤维素酶催化活性部位的结构、活性中心表面电势都有较大的差别。对内切纤维素酶与寡糖相互作用的π-H相互作用和氢键进行了分析,确定了每种内切纤维素酶与寡糖相互作用的关键氨基酸残基,并对这些氨基酸残基的分布进行了分析,得出了与实验结果基本一致的结论。这说明同种微生物分泌的多种内切纤维素酶具有不同的作用模式,应有不同的生物学功能。4、利用荧光光谱方法实现了纤维素酶与底物结合的动力学定量测定,为研究蛋白质分子与糖分子配体之间的相互作用提供了一种可行的方法。利用该方法定量表征出以pNPC为底物检测外切纤维素酶活性时会高估相应催化活力。纤维素酶可以特异性识别并结合纤维素,其中活性中心的色氨酸等芳香族氨基酸残基在底物识别过程起着重要作用。色氨酸残基可以被295 nm的激发光激发,发射355 nm的荧光,当色氨酸残基与糖分子等配体结合后会诱导电子轨道变化发生荧光淬灭,其淬灭强度与配体分子的结合量之间具有剂量效应关系。基于此,本研究利用荧光光谱方法对糖苷水解酶与底物结合的动力学过程进行了定量分析。通过对淬灭曲线的单点/多点结合动力学曲线拟合分析,明确区分了糖苷水解酶单点特异性结合与多点非特异性结合的定量关系,利用特异性结合区间定量测定了糖苷水解酶与底物结合过程动力学常数以及其自由能变化,同时定量分析了外切纤维素酶底物类似物对硝基苯β-D纤维二糖苷(pNPC)作为外切纤维素酶活性表征底物的局限性,发现以pNPC为底物检测纤维素外切酶酶活时会有过高的正向偏差。基于色氨酸残基结合配体荧光光谱的定量分析可以准确分析糖苷水解酶与底物结合的动力学过程,有助于促进蛋白质与多糖相互作用的深入研究,可为研究蛋白质分子与小分子配体之间的相互作用提供了一种可行的方法。(本文来源于《山东大学》期刊2015-05-18）
齐飞飞,刘巍峰[4]（2014）在《瑞氏木霉纤维素外切酶CBH1N-糖基化修饰在其折迭分泌中的作用》一文中研究指出丝状真菌瑞氏木霉(Trichoderma reesei)在纤维素底物存在情况下可大量地分泌产生纤维素酶,是重要的纤维素酶工业生产菌株。虽然基因组序列测定已经完成,但已有的信息还不足以阐明瑞氏木霉高水平表达与分泌纤维素酶的机制。N-糖基化修饰在蛋白质的折迭分泌、结构功能以及蛋白的稳定性等方面发挥着重要的作用,正确位点的N-糖基化修饰被认为是蛋白质正确折迭与分泌以及保持结构稳定性的结构基础。瑞氏木霉胞外主要的纤维素外切酶CBH1有叁个天冬酰胺位点发生N-糖基化修饰,分别为N45、N270以及N384。其中N45位于催化结构域通道的入口处,N270靠近催化结构域中纤维二糖的释放端,而N384(本文来源于《2014年第七届中国模式真菌研讨会论文摘要集》期刊2014-05-30）
徐金涛,刘巍峰[5]（2014）在《瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶在乳糖诱导纤维素酶基因表达过程中的作用机制研究》一文中研究指出丝状真菌瑞氏木霉(Trichoderma reesei)是工业生产纤维素酶最重要的菌株之一,它在不溶性的纤维素及半纤维素存在条件下能够大量分泌纤维素酶,从而有效水解植物生物质。除了纤维素,作为非植物细胞壁组分的乳糖也可以诱导瑞氏木霉有效产生纤维素酶,但目前其诱导表达机制仍不甚清楚。我们深入研究了瑞氏木霉中位于糖苷水解酶第1家族的胞内β-葡萄糖苷酶Cella和Cellb的乳糖水解活性以及它们在乳糖诱导纤维素酶表达过程中发挥的作用及作用机制。获得的主要结果如下:一,β-葡萄糖苷酶Cella和Cellb具有乳糖水解活性和转化活性。异源表达纯化的Cella和Cellb不仅能够水解纤维二糖及其类似物pNPG,还能够水解乳糖类似物ONPG,证明其(本文来源于《2014年第七届中国模式真菌研讨会论文摘要集》期刊2014-05-30）
齐飞飞[6]（2014）在《N-糖基化修饰对瑞氏木霉纤维二糖水解酶I分泌、酶活和蛋白稳定性的影响及影响机制的研究》一文中研究指出以瑞氏木霉(Trichoderma reesei)为代表的丝状真菌是重要的纤维素酶工业生产菌株,此霉在纤维素底物存在情况下可大量地分泌产生纤维素酶,降解纤维素释放还原糖。虽然它的基因组序列的测定已经完成,但已有的信息却还不足以充分说明其纤维素酶高水平表达分泌的机制。纤维二糖水解酶I(Cellobiohydrolase I, CBH1,也称Ce17A)是它分泌的纤维素酶系组分中含量最大的蛋白,有研究表明,CBH1约占瑞氏木霉分泌的纤维素酶总量的60%。瑞氏木霉分泌的纤维素酶大部分都是多结构域的,包含一个催化结构域(Catalytic domain, CD)和一个催化结合结构域(Carbohydrate-binding domain, CBD),中间由一个柔软且高O-糖基化修饰的连接桥(Linker)相连。蛋白质的N-糖基化修饰在增加糖蛋白的正确折迭分泌、减少折迭过程中的蛋白聚集、保证糖蛋白的结构和功能以及维持糖蛋白的稳定性等很多方面发挥着重要的作用。在正确位点发生N-糖基化修饰,被认为是蛋白质正确折迭成功分泌以及保持蛋白稳定性的基础。瑞氏木霉CBH1的CD结构域上存在着四个潜在的N-糖基化位点,其中的叁个天冬酰胺(asparagine, Asn)位点(N45、N270和N384)处会发生糖基化修饰,N45位于催化结构域通道的入口处,N270靠近催化结构域通道中纤维二糖的释放端,而N384位于催化结构域底部的loop环上。有研究推测N384位点上N-糖基的作用是稳定催化通道的结构,这或许会影响到纤维二糖从催化通道中的释放。迄今为止,这些位点上发生的N-糖基化修饰对CBH1分泌效率及结构功能的重要性研究的还不是很透彻。目前,所有关于CBH1 N-糖基化的缺失突变研究都是通过异源表达体系进行的,尚未见在瑞氏木霉本体内进行过相关研究。但CBH1上N-糖基化的修饰形式会随着表达宿主的不同以及生长条件的不同而不同,进而可能影响CBH1的酶活和稳定性等,因此为了更加系统的在瑞氏木霉本体内研究不同糖基化位点上发生的N-糖基化修饰对CBH1折迭分泌、酶活和稳定性的重要性,我们通过将N45、N270或N384位点上天冬酰胺分别单点和多点组合突变为谷氨酰胺(glutamine, Gln),构建了一系列分泌N-糖基缺失CBH1蛋白的瑞氏木霉菌株,并对不同突变体分泌CBH1的能力进行了研究。同时,纯化获得了各种N-糖基缺失的CBH1蛋白,并对其水解活性和蛋白稳定性的变化进行了研究。本论文主要的创新研究结果如下：1.构建了cbhl敲除菌株,在此基础上获得了一系列可以分泌N-糖基缺失CBH1蛋白的瑞氏木霉菌株,并在野生菌株和叁缺菌株中敲除了cnel基因。为了在瑞氏木霉本体内表达N-糖基缺失的CBH1蛋白,本研究首先以yrG为筛选标记利用同源双交换的策略在瑞氏木霉体内敲除了cbhl基因。然后构建了以cbhl启动子和构巢曲霉色氨酸合成酶基因终止子(trpC)为控制元件的通用表达载体,通过融合PCR分别将不同N-糖基化位点上的Asn突变为Gln,构建了一系列不同N-糖基化位点发生突变的CBH1回补载体。利用原生质体转化法将敲除盒转化至cbhl敲除菌株Acbhl,经过潮霉素(120μg/mL)和5-氟乳清酸(1.2mg/mL)平板复筛,单孢分离,PCR验证,DNA测序和Southern blot检测,获得了一系列可以分泌不同N-糖基缺失CBH1蛋白的瑞氏木霉菌株,为下一步研究N-糖基化修饰与CBH1折迭分泌、酶活和蛋白稳定性的关系打下了基础。此外,我们还在野生菌株和叁缺菌株中敲除了cnel基因。2.研究了N-糖基化修饰缺失对瑞氏木霉CBH1折迭分泌的影响,发现CBH1上N-糖基化的完全缺失虽不影响CBH1的整体分泌水平,但触发了胞内的非折迭蛋白响应(unfolded protein response, UPR)。研究发现,CBH1单个位点上N-糖基的缺失,两个位点上N-糖基组合缺失甚至叁个位点上N-糖基同时缺失均未明显影响到胞外CBH1的分泌量。尽管N-糖基化的缺失并未明显影响到分泌到胞外的CBH1的量,但是在分泌CBH1 N-糖基完全缺失的瑞氏木霉体内却触发了UPR反应,一些与折迭相关的分子伴侣(cnel)和UPR相关基因(pdil和bbip1)的转录量获得了提升,而在分泌单个位点上N-糖基化缺失CBH1的突变株体内则未发现该现象。此外,研究还发现单独敲除Calnexin基因对CBH1的分泌没有产生明显影响,而如果我们将该基因在叁缺菌株中敲除,则会明显降低CBH1的分泌量。最后,根据不同位点上N-糖基化缺失后对CBH1的泳动速度的影响推测,N45和N384位点上发生的N-糖基化的形式应该是最简单的GlcNAc的形式,而N270位点上发生的N-糖基化形式则应该是(ManP)0-1GlcMan7-8GlcNAc2或者(Man1-2P)0-1-2Man5-6-7GlcNAc2。3.从发酵液中分离纯化了所有N-糖基化缺失的CBH1蛋白,分析比较了野生蛋白与突变蛋白酶活和蛋白稳定性的差异。为了研究不同位点上的N-糖基发生缺失的CBH1的性质,我们首先建立了重组CBH1的纯化方法。瑞氏木霉发酵液依次经过硫酸铵沉淀、G25除盐、弱阴离子交换柱层析(DEAF Fast Flow)和强阴离子交换层析(Mono Q)分离而得到纯酶组分,通过western blot和质谱鉴定确定了所纯化组分即为目的蛋白CBH1。接下来,利用纯化的蛋白分析了不同位点上的N-糖基化修饰与CBH1酶活以及与蛋白稳定性之间的关系。研究发现,叁个N-糖基化位点上任何一个N-糖基的缺失甚至全部缺失都未明显影响CBHl降解可溶性底物pNPC和不溶性底物Avicel的能力。但是,叁个N-糖基化位点上的糖基在维持CBH1热稳定性方面起到的作用却是不同的。位于催化通道底部loop环上的N384位点上的N-糖基和位于催化通道入口处N45位点上的N-糖基的缺失都会影响CBH1的热稳定性,而两个位点上N-糖基的同时缺失则会加剧蛋白的不稳定性。CD光谱分析表明,与发生在N45位点的糖基化修饰相比,N384位点上的糖基化修饰之所以在维持CBH1热稳定性方面起着重要作用,在于它可以维持酶的二级结构。研究还发现,CBH1与不溶性底物结合后可以更加有效的保持其蛋白二级结构而不容易失活。同时N-糖基缺失的CBH1蛋白在高pn条件下尽管丧失了活性但它的二级结构并未发生变化,这说明温度和pH影响CBH1活性的机制是不同的。4.对α-1,2甘露糖苷酶1(mnslp)和内质网降解增强α-甘露糖苷酶类似蛋白1(ER degradation enhancing alpha-mannosidase-like protein, EDEM1, mnl1p)进行了敲除,研究了二者在瑞氏木霉利用纤维素过程中对纤维素酶表达的影响。为了获得mns1p和mnl1p基因的缺失菌株,我们构建了相关同源敲除盒,转化重组到瑞氏木霉基因组上获得了Amns1p和△mnl1p敲除菌株,观察发现野生菌株和两个敲除菌株在不同碳源上的生长能力和菌丝形态差别并不大,同时两个基因的敲除都未明显影响到CBH1的胞外分泌量,其中△mnslp胞外分泌液降解Avicel的能力有所增加而Amnl1p则有所降低,但二者的比酶活均低于野生型,且Amnslp胞外分泌液的pNPC比酶活要高于野生菌株TU6,但降解CMC的能力两个敲除菌株则与野生型无太大差别。接下来,对两个基因缺失菌株分泌的CBH1蛋白进行了纯化,结果在△mnslp菌株的胞外分泌液中发现了两种N-糖基化形式的CBH1,这两种N-糖基化形式的CBH1有着相似的水解pNPC和Avicel底物的能力,但它们的Tm值却并不相同,其中有着高甘露糖N-糖基化形式的CBH1比简单N-糖基化形式的CBH1更加稳定,这说明N-糖链的长度和组成也会影响到CBH1蛋白的热稳定性。(本文来源于《山东大学》期刊2014-05-26）
徐金涛[7]（2014）在《瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶在纤维素酶诱导表达过程中作用机制的研究》一文中研究指出木质纤维素来源的生物燃料是一种清洁的可再生能源,能部分替代目前人们对化石能源的需求,然而就目前的技术水平而言,将植物生物质高效转化为可发酵的单糖是生物燃料生产的主要瓶颈。自然界中存在大量能够降解植物生物质的微生物,是我们转化和利用木质纤维素的基础。其中丝状真菌瑞氏木霉(Trichoderma reesei)是纤维素降解微生物的典型代表,它的一个重要生理特性是在不溶性的纤维素、半纤维素以及一些植物生物质组分存在条件下,能够大量分泌纤维素酶,从而有效水解植物生物质。因为这些不溶性的底物无法进入细胞,由它们释放的可溶性寡糖包括纤维二糖以及槐糖等被认为是真正的诱导物,但目前这种假设还缺少足够的实验证据。除了纤维二糖和槐糖,非植物细胞壁组分的乳糖也可以诱导瑞氏木霉产生纤维素酶,但目前人们对乳糖诱导纤维素酶表达的机制也不甚了解。虽然有实验证据表明乳糖的胞外水解以及随后的半乳糖代谢与纤维素酶诱导表达有一定相关性,但是也有证据表明瑞氏木霉对乳糖的吸收和胞内代谢在纤维素酶的诱导表达过程中起到重要作用。到目前为止在瑞氏木霉中负责胞内水解和转化乳糖的蛋白尚未得到鉴定。有证据显示瑞氏木霉p-葡萄糖苷酶在诱导物合成以及菌体快速响应纤维素的过程中发挥重要作用,例如胞外主要p-葡萄糖苷酶bgl1/cel3a基因的缺失导致纤维素酶基因诱导表达延迟,而过表达bgl1/cel3a基因的菌株在纤维素和槐糖诱导条件下纤维素酶基因的表达水平提高。基因组信息分析表明,瑞氏木霉一共含有11个p-葡萄糖苷酶编码基因,其中Bgl1/Cel3a是胞外主要的p-葡萄糖苷酶,属于糖苷水解酶第3家族,而Cel1a和Cel1b是胞内p-葡萄糖苷酶,属于糖苷水解酶第1家族。转录组学数据显示,这叁个p-葡萄糖苷酶在纤维素和乳糖诱导条件下转录上调最为显着,是瑞氏木霉最主要的p-葡萄糖苷酶,它们在瑞氏木霉纤维素酶基因诱导表达过程中的作用有待于进一步的研究。大多数糖苷水解酶第1家族的p-葡萄糖苷酶同时具有p-半乳糖苷酶活性,是乳糖胞内代谢酶的重要候选蛋白,瑞氏木霉第1家族的p-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b是否具有乳糖水解活性以及它们在乳糖诱导纤维素酶表达过程中是否发挥作用目前还不清楚。为了深入阐释瑞氏木霉叁个主要的β-葡萄糖苷酶Bgl1/Cel3a、Cel1a和Cel1b在纤维素酶基因诱导表达过程中的作用,我们将这叁个β-葡萄糖苷酶的编码基因分别进行了敲除以及组合多敲除。详细研究了β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株响应纤维素、纤维二糖、槐糖以及乳糖等碳源表达纤维素酶的能力,对瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶影响纤维素酶诱导表达的机制进行了分析。同时研究了瑞氏木霉两个糖苷水解酶第1家族的β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b对乳糖的水解和转化作用,并分析了Cel1a和Cel1b对乳糖诱导纤维素酶表达的影响及其发挥作用的机制。本论文的主要创新结果如下：1.对瑞氏木霉叁个主要β-葡萄糖苷酶编码基因bgl1/cel3a, cel1a以及cel1b进行基于同源重组原理的基因敲除,同时构建了多基因缺失菌株△cel1a△cel1lb和△tripG,以研究不同β-葡萄糖苷酶的生物学功能。为了研究不同β-葡萄糖苷酶的功能,我们通过同源双交换的手段构建了一系列β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株△cel1a,△cel1b,△cel1a△cel1b和△tripG(bgll, cel1a和cel1b同时缺失),锚定PCR以及Southern blot验证了基因敲除以及单拷贝整合。我们进一步分析了不同β-葡萄糖苷酶的缺失对瑞氏木霉胞内外β-葡萄糖苷酶总酶活的影响。在纤维素培养条件下,与野生型菌株相比△cel1b菌株胞内β-葡萄糖苷酶酶活只有轻微下降,而△cel1a菌株胞内β-葡萄糖苷酶酶活下降75%,△cel1a△cel1b菌株胞内β-葡萄糖苷酶酶活与△cel1a菌株类似,说明Cella是胞内主要的β-葡萄糖苷酶,Cel1b对胞内总β-葡萄糖苷酶酶活的贡献不大。Bgl1/Ce13a缺失后瑞氏木霉胞外β-葡萄糖苷酶活性仅有10%残留,说明Bgl1/Ce13a是瑞氏木霉胞外最主要的β-葡萄糖苷酶。2.比较了不同β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株在纤维素以及槐糖上的生长和纤维素酶诱导表型,证明在不溶性纤维素诱导条件下纤维素酶基因的快速诱导表达需要β-葡萄糖苷酶的参与。我们首先研究了瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶是否参与不溶性纤维素诱导纤维素酶表达的过程。通过测定不同β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株在纤维素培养过程中的生长曲线,我们发现β-葡萄糖苷酶的缺失影响菌株对纤维素的利用。此外,在纤维素诱导条件下β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株发酵液中总蛋白量和纤维素酶酶活均比野生型菌株低。我们进一步使用Northern blot和qRT-PCR的方法研究了纤维素诱导条件下不同β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株纤维素酶基因cbh1的转录动力学。结果显示瑞氏木霉野生型菌株在纤维素诱导3h之后cbh1转录即可达到较高水平,而△cel1b菌株需要诱导6h,△cel1a菌株需要诱导24h,△cel1a△cel1b菌株需要诱导36h,△triβG菌株则需要诱导48h才能达到与野生型类似的水平。β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株发酵液中CBHI的表达也呈现与转录类似的结果。与纤维素不同,槐糖诱导条件下△cel1a△cel1b菌株cbhl转录动力学与野生型一致,说明β-葡萄糖苷酶在槐糖诱导纤维素酶表达过程中并未发挥重要作用。综上所述,我们证明了这叁个β-葡萄糖苷酶在瑞氏木霉菌株快速响应纤维素启动纤维素酶表达过程中发挥了重要作用,它们有可能参与了诱导物的合成。3.通过分析在纤维二糖诱导条件下瑞氏木霉主要β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株的纤维素酶表达表型,证明主要β-葡萄糖苷酶的缺失能提高纤维二糖对纤维素酶的诱导能力,瑞氏木霉主要β-葡萄糖苷酶对纤维二糖的转化作用在纤维素酶诱导表达过程中并未发挥重要作用。作为纤维素的主要降解产物,纤维二糖在低浓度下也可以诱导瑞氏木霉产生纤维素酶,而且有证据显示瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶能够在体外将纤维二糖通过转糖基作用转化为槐糖这一强效诱导物。为了分析瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶在纤维二糖诱导纤维素酶表达过程中发挥的作用,首先我们摸索了在瑞氏木霉中纤维二糖诱导纤维素酶表达的最佳浓度。实验确定0.25%(w/v)纤维二糖为最佳诱导浓度。其次我们通过Western blot测定了β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株发酵液中CBHI表达量,并使用qRT-PCR检测了菌体纤维素酶cbhl基因的转录水平,结果显示在纤维二糖诱导条件下β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株中纤维素酶的表达水平明显高于野生型,说明降低瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶的活性能提高纤维二糖诱导纤维素酶表达的能力,瑞氏木霉主要的β-葡萄糖苷酶对纤维二糖的转化作用在纤维素酶的诱导表达过程中并未发挥重要作用。最后,我们在纤维素培养过程中外源添加一定比例的纤维二糖,发现β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株快速响应纤维素产生纤维素酶的能力得到恢复,表明β-葡萄糖苷酶可能通过调控胞外纤维二糖的水平影响纤维素诱导条件下纤维素酶基因的快速表达。4.证明瑞氏木霉胞内主要β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b在乳糖诱导纤维素酶表达过程中发挥重要作用。Cel1a和Cel1b的缺失影响纤维素酶基因转录调控因子Xyrl的表达,但是组成型回补表达Xyr1并不能恢复β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株响应乳糖产生纤维素酶的能力。瑞氏木霉糖苷水解酶第1家族的β-葡萄糖苷酶是乳糖胞内代谢酶的重要候选蛋白,因此我们分析了β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b是否影响菌体对乳糖的利用以及乳糖诱导纤维素酶基因的表达。通过生长曲线的测定,我们发现胞内p-葡萄糖苷酶的缺失影响菌体在乳糖碳源上的生长,但是并不影响菌体对半乳糖的利用。通过Western blot分析乳糖培养条件下β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株发酵液中纤维素酶CBHI的表达,我们发现β-葡萄糖苷酶基因cel1a的缺失导致乳糖诱导纤维素酶表达延迟,而在双缺菌株△cel1a△cel1b中纤维素酶的表达完全缺失。进一步通过qRT-PCR分析纤维素酶基因cbh1的转录发现β-葡萄糖苷酶基因缺失菌中纤维素酶表达的滞后或缺失发生在转录层面,说明瑞氏木霉胞内β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b对乳糖诱导纤维素酶表达是必需的。Xyr1是调控纤维素酶基因诱导表达的关键转录因子,因此我们分析了β-葡萄糖苷酶基因缺失菌株中xyr1基因的转录水平,实验发现虽然β-葡萄糖苷酶的缺失造成xyr1基因的转录水平降低,但在△cel1a△cel1b菌株中组成型表达xyr1并不能恢复菌株响应乳糖产生纤维素酶的能力。上述结果表明胞内β-葡萄糖苷酶在乳糖诱导纤维素酶表达过程中发挥了重要作用,β-葡萄糖苷酶不仅影响了关键转录因子Xyr1的表达,还通过其他途径影响乳糖诱导纤维素酶表达的过程,β-葡萄糖苷酶发挥作用的机制还需要进一步的分析。5.通过分析Cel1a和Cel1b重组蛋白的底物特异性,证明瑞氏木霉糖苷水解酶第1家族的β-葡萄糖苷酶具有乳糖水解活性和转化活性。糖苷水解酶第1家族的β-葡萄糖苷酶往往具有β-半乳糖苷酶活性,瑞氏木霉糖苷水解酶第1家族的β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b可能在乳糖胞内代谢过程中发挥作用。因此我们通过大肠杆菌异源表达和纯化了瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b,并对其底物特异性进行了分析。我们发现Cel1a和Cel1b不仅能够水解纤维二糖及其类似物pNPG,还能够水解乳糖类似物DNPG,证明其具有β-半乳糖苷酶活性。通过HPLC分析β-葡萄糖苷酶Cel1a与乳糖反应的产物,我们发现除了D-葡萄糖和D-半乳糖,还有其他半乳寡糖产生,表明β-葡萄糖苷酶Cel1a可能具有乳糖转糖基活性。瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶具有的这种糖苷水解活性在纤维素酶诱导表达过程中的作用还需要进一步的研究。6.证明了瑞氏木霉主要β-葡萄糖苷酶具有的糖苷水解活性对乳糖诱导纤维素酶表达是必需的。为了进一步分析瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶Cel1a和Cel1b所具有糖苷水解活性对乳糖诱导纤维素酶表达的影响,我们在瑞氏木霉△cel1a菌株中组成型表达了野生型Cel1a蛋白以及水解活性缺失点突变体Cel1a (Q367A)蛋白。在乳糖诱导条件下,组成型回补野生型Cel1a蛋白使得△cel1a菌株cbh1的转录得到恢复,cbh1转录起始时间甚至比野生型提前,cbh1转录量也有所升高,而回补水解活性缺失点突变体Cella (Q367A)蛋白的菌株cbh1转录并未恢复,转录起始时间与野生型相比仍然有明显的滞后,这些结果说明Cel1a的糖苷水解活性对乳糖诱导纤维素酶的表达是必需的。为了进一步分析β-葡萄糖苷酶具有的乳糖水解活性在纤维素酶诱导表达过程中的作用,我们在△cel1a菌株中组成型表达了乳酸克鲁维酵母来源的胞内β-半乳糖苷酶Lac4,结果显示回补Lac4并不能恢复△cel1a菌株纤维素酶基因cbh1的转录,表明仅有乳糖胞内水解活性并不足以启动纤维素酶的诱导表达,Cel1a还通过其他途径对纤维素酶基因的诱导表达产生影响。(本文来源于《山东大学》期刊2014-05-26）
洪玉[8]（2014）在《利用随机整合和基因置换策略在瑞氏木霉中异源表达栓菌漆酶的研究》一文中研究指出漆酶(laccase)是一类能够氧化酚类和芳香胺底物的多铜氧化酶,可用于纸浆脱木素、废水处理及生物传感器等,在工业和生物技术领域应用广泛。栓菌Trametes sp. AH28-2是白腐真菌的一种,能分泌laccase A (LacA)、LacB、LacC叁种漆酶同工酶,其中LacA为主要酶组分,在降解稻草秸杆的木质素成分、降低制浆废水处理耗氧量方面效果十分明显。LacA编码基因被克隆后,在毕赤酵母(Pichia pastoris)和瑞氏木霉(Trichoderma reesei}中均已实现表达。但是,毕赤酵母所分泌重组漆酶的热稳定性较差,最适催化pH降低,pH耐受性范围缩小,而瑞氏木霉所分泌的重组漆酶的酶学特性更接近其原始菌株Trametes sp.AH28-2。瑞氏木霉能够大量分泌纤维素酶,是目前研究纤维素降解的重要模式真菌。因为具有强大的蛋白分泌能力和真核生物的蛋白加工修饰特点,瑞氏木霉也是极具潜力的异源蛋白表达真核宿主。瑞氏木霉纤维二糖水解酶CBHI (Cel7a)可占总蛋白分泌量的60%左右,而且该编码基因cbh1为单拷贝,所以cbh1启动子Pcbh1是异源蛋白表达时常采用的强启动子。另外,鉴于真核生物染色体的转录具有位置效应,cbh1基因位点也可能是潜在的高效基因转录表达的位点。因此,本研究一方面采用cbh1基因强启动子Pcbh1控制下的LacA编码基因(lacA)直接随机整合入瑞氏木霉染色体中进行异源表达；另一方面,利用cbh1基因位点作为靶位点将lacA基因整合入染色体来研究LacA的异源表达情况。本研究利用上述两种表达策略探索了瑞氏木霉高效表达异源漆酶的潜力,同时,也分析了非折迭蛋白响应及内质网相关蛋白降解途径的诱发情况。第一部分工作利用随机插入策略表达异源漆酶研究。首先,采用Double-jointPCR及分子克隆技术构建了Pcbh1控制的lacA基因表达载体pCGTLacA。该载体包括瑞氏木霉Vcbh1为启动子控制的含有cbh1信号肽序列的lacA表达盒(Pcbh1-lacA)、乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶基因表达盒(pyrG,作为筛选标记)以及瑞氏木霉cbh1基因下游序列(Tcbh1)。以pCGTLacA为模板,PCR扩增lacA表达盒和pyrG表达盒片段Pcbh1-lacA-pyrG用于随机整合,片段纯化后转化瑞氏木霉原生质体,在无尿嘧啶平板中筛选转化子126株,通过ABTS平板显色法直接筛选表达漆酶菌株,然后进行PCR分析及Southern blot等分子水平的验证,最终确认7株分别含有lacA基因1或2个拷贝数的重组菌株。采用多种培养基进行发酵条件优化,但菌株生长状况一直不佳,胞外蛋白分泌量较低,且未检测到漆酶活力。为了深入分析异源漆酶LacA基因的转录和表达分泌情况,随后利用菌体转接诱导方法检测了Tulac118转化子在乳糖诱导条件下的漆酶基因lacA表达水平,以及非折迭蛋白压力响应(UPR)和内质网相关降解途径(ERAD)相关因子的表达水平。结果显示Tulac118中lacA基因成功转录,并在12h时表达量最高；UPR相关因子分子伴侣bip1略有上调但明显低于DTT处理菌株,然而ERAD相关因子上调程度十分明显,其中,识别错误折迭蛋白底物的泛素化连接酶E3编码基因hrd1在诱导8h时上调幅度为DTT处理的菌株的5.46倍。这说明在液体发酵条件下,Tulac118菌株中异源漆酶LacA在折迭和分泌过程中遇到了障碍,这可能是本实验条件下漆酶LacA没有分泌到胞外的原因。第二部分工作利用基因定位置换策略表达异源漆酶。以pCGTLacA为模板扩增可以置换cbhl基因位点的含有lacA表达盒的片段Pcbhl-lacA-pyrG-Tcbh1。该片段中Pcbhl既是lacA基因表达的启动子元件,又与Tcbhl共同作为置换瑞氏木霉cbh1基因位点的上游和下游同源臂。将该片段转化瑞氏木霉原生质体,在无尿嘧啶平板上筛选转化子,然后进行PCR验证、平板显色鉴定,筛选到实现cbh1位点被lacA定点整合的目的菌株TLac3。利用菌体转接诱导方法检测了TLac3菌株lacA基因表达情况。与对照菌株cbh1基因表达水平相比,lacA基因的诱导约晚10h,但其最高表达量与cbh1相当。同时,在TLac3菌株中检测到UPR相关因子bip1和pdi1转录大幅上调,且在诱导9h时均高于DTT处理菌株；ERAD相关因子也明显上调,但与DTT处理菌株相当。这说明,TLac3菌株中异源LacA的表达诱发了显着的UPR响应,并在一定程度上激活了ERAD途径,但ERAD上调程度不如TuLac118显着。在随后的发酵培养中,成功检测到漆酶活力,最高活力为168.32U/L。重组漆酶最适催化温度35℃,最适催化pH为4.0,pH耐受范围为2.4-8.0。上述结果显示,lacA基因通过置换cbh1基因位点成功表达,重组蛋白分泌到胞外,酶学性质稳定。(本文来源于《山东大学》期刊2014-05-18）
宫亚娟[9]（2014）在《瑞氏木霉纤维素酶基因cbh1启动子突变分析及psi因子合成酶基因的功能研究》一文中研究指出瑞氏木霉(Trichoderma reesei)是工业化的纤维素酶生产菌株,可以分泌高效降解纤维素的酶系,其中纤维二糖水解酶CBHⅠ是降解纤维素的重要酶组分。瑞氏木霉纤维素酶基因的诱导表达受到碳源、转录调控因子及很多与次级代谢有关因素的影响。瑞氏木霉纤维素酶基因cbhl启动子上存在大量的5'-GGC(A/T)3-3'序列,其中5个5’-GGC(A/T)3-3'序列能够与转录激活因子Xyrl的DNA结合结构域XyrlDBD)结合。本论文采用体外酵母单交杂方法与瑞氏木霉体内检测cbhl启动子的突变体活性相结合的手段,研究了这5个5'-GGC(A/T)3-3'序列中第二个鸟嘌呤核苷酸的突变对转录因子Xyrl与其结合能力的影响。同时,本文通过构建瑞氏木霉缺失突变体的手段,研究了参与多种次级代谢产物合成过程的psi因子合成酶Ppo对纤维素酶诱导表达的影响。本论文取得的的主要研究结果如下：1.酵母单杂交分析cbhl启动子点突变后活性变化,证明转录因子Xyrl可能与cbhl启动子中的4个5,-GGC(A/T)3-3'序列结合而影响cbhl的表达。为了探讨Xyrl与cbh1启动子可能的结合位点及相互作用机制,对启动子中5个5’-GGC(A/T)3-3'序列(分别位于cbh1启动子上-187R、-320、-510R、-733R、-778位)中第二个鸟嘌呤核苷酸分别进行了点突变。采用酵母单杂交的技术手段,通过检测报告基因lacZ表达的p-半乳糖苷酶酶活水平来研究这些点突变对Xyrl的DNA结合结构域(Xyrl DBD)与启动子结合能力的影响。结果显示,突变位点为cbh1p-510R的突变株的p-半乳糖苷酶酶活与表达野生型cbhl启动子的菌株基本一致；突变位点分别为cbh1p-187R、cbh1p-320、cbh1p-733R、cbhlp-778的突变株的酶活则分别下降了23%、15%、26%和24%。据此推测,cbh1p-187R、 cbhlp-320、cbhlp-733R和cbhlp-778四个位点处的5'-GGC(A/T)3-3'序列均有可能参与了Xyrl与cbhl启动子的结合。2.在瑞氏木霉体内利用uidA作为报告基因分析cbhl启动子点突变对其活性的影响,证明5'-GGC(A/T)3-3'序列参与了Xyrl与cbh1启动子的结合。通过构建表达载体,将上述cbh1启动子上5个六核苷酸序列5'-GGC(A/T)3-3'中第二个鸟嘌呤核苷酸分别突变的启动子序列分别表达在瑞氏木霉中,采用uidA作为报告基因,通过检测GUS酶活水平分析突变后的cbh1启动子活性,并与体外酵母单杂交实验得到的数据进行分析和比较。结果显示,突变位点为cbh1p-510R的突变株酶活与野生型基本一致；突变位点分别为cbh1p-187R、cbh1p-320、cbhlp-733R、cbhlp-778的突变株酶活分别下降了50%、43%、45%和43%。推测点突变对cbhl启动子活性的影响主要是由转录因子Xyrl与启动子相互作用的变化引起,cbhlp-187R、cbhlp-320、 cbhlp-733R、cbhlp-778位点处的六核苷酸序列参与了Xyrl与cbhl启动子的结合。3.编码瑞氏木霉psi因子合成酶Ppo基因ppoa和ppob的缺失突变表明,ppo基因参与碳源底物代谢,影响菌体生长。Psi因子合成酶Ppo参与了很多次级代谢产物的合成过程。为了研究psi因子合成酶在瑞氏木霉纤维素酶诱导合成中的作用,我们对两个编码psi因子合成酶的基因ppoa和ppob分别进行了基因敲除,构建Δppoa和Δppob,并对缺失菌株的表型进行了研究。结果显示,ppo基因的缺失影响了菌株在以麦芽浸膏、乳糖、木糖、葡萄糖、羧甲基纤维素钠、纤维二糖、甘油、微晶纤维素、木聚糖分别为唯一碳源的固体平板上的生长,促进了菌株的衰老以及次级代谢产物如色素的产生。通过对缺失菌在微晶纤维素诱导条件下发酵液pNPC酶活的测定和对CBHⅠ信号的Western免疫印迹检测,发现ppo的缺失对瑞氏木霉纤维素酶的诱导表达并没有太大影响。(本文来源于《山东大学》期刊2014-05-17）
陈林[10]（2014）在《瑞氏木霉QM9414在不同碳源条件下动态酶谱及胞外蛋白质组学分析》一文中研究指出随着全球能源消费的日益递增,石油等化石能源持续消耗,人类社会正面临着能源危机以及日益严峻的环境问题,大力发展生物质能源可望为解决能源短缺的难题做出贡献。木质纤维素作为可再生的生物质是能够被转化为液体燃料,并且成本低廉可用性强等特点,被认为是生产生物燃料的理想原料。然而,由于木质纤维素结构复杂、成分多样,以及其各组成成分(纤维素、半纤维素,以及木质素)间常交链成复杂的超分子结构,形成了生物质抗降解的屏障,致使无论是原核的细菌还是真核的丝状真菌,都难以对其进行高效的降解。由于木质纤维素结构复杂层次性强,其降解所需要的酶的种类也众多,包括纤维素降解酶系,半纤维素降解酶系,果胶降解酶系以及一些和降解相关的辅助蛋白。瑞氏木霉于2008年获得全基因组测序,从基因组的分析显示共有200个基因编码糖苷水解酶,其中有10个基因编码熟悉的纤维素酶(2个外切纤维素酶,5个内切纤维素酶),16个基因编码半纤维素酶,103个糖基转移酶。由此可见不仅木质纤维素的组成复杂,其降解所需的酶也很复杂,要彻底高效的降解木质纤维素,了解真菌降解过程中各种酶的组合以及分泌的次序性才是关键。因此,本文探究降解酶系的分泌是否随底物的种类,浓度的不同而发生变化。酶分子等蛋白质分子之间在分泌次序上是否有相关性。本论文对瑞氏木霉菌株QM9414在不同碳源条件下(单糖,二糖,木聚糖,秸秆麸皮)的动态酶谱以及产物谱进行了分析,对不同条件下蛋白质组学分析结果结合转录调控因子结合位点进行了相关分析,并取得了以下新的研究结果。1.建立了展示胞外酶系动态酶谱及其产物谱的研究技术方法通过胞外酶系活性测定与Native-PAGE酶谱技术相结合,将粗酶液中胞外酶系酶活的高低在一维时间上的动态变化表征过渡到不同糖苷酶种类随时间的动态表征,特别是展示了不同同工酶的表达分泌差异,使胞外酶系分析更为精细。该方法与终点法测定粗酶液酶活大小相比,胞外动态酶谱技术不仅能够反映酶系总酶活的变化,而且还能反映酶系中同工酶的种类以及其含量的动态变化情况。FACE电泳(荧光辅助糖电泳)对比溶液中还原糖中总糖的量的测定方法不仅可反映还原糖的总量的变化更能区分不同系列寡糖的随时间浓度的时序性变化情况,这就为下一步不同碳源及浓度下胞外蛋白酶谱及产物谱的相关性分析奠定了基础。2.分批发酵培养条件下不同碳源时胞外糖苷水解酶酶谱及其产物谱的动态分析通过Native-PAGE电泳技术与FACE电泳技术相结合,对酶谱与产物谱的相关性进行分析,结果表明1%的葡萄糖和1%木糖发酵5天并不能诱导纤维素酶的产生,1%乳糖具有较强的诱导能力,在发酵第2天就有纤维素酶和木聚糖酶的分泌。1%纤维二糖没有纤维素酶和木聚糖酶的分泌,产物谱分析发现其能被β-葡萄糖苷酶降解成葡萄糖从而产生碳代谢阻遏的抑制。1%木聚糖诱导能力较强,高于乳糖的诱导能力,CMC酶活较乳糖提高了15%,木聚糖酶酶活提高了了2倍。产物谱分析显示发酵过程有大量的木寡糖产生,木寡糖可能是强诱导物。秸秆麸皮作为天然的生物质,在发酵5天的过程中,结合产物谱和酶谱的分析显示,发酵初期第1天产生少量的可溶性糖成分,诱导出少量的酶组分,第2天培养基中检测到酶解产生的大量高聚合度的寡糖,到第3天这些寡糖诱导出大量的内切纤维素酶和木聚糖酶。结晶纤维素PH105为碳源时未诱导纤维素酶的产生,但是当PH105分别和乳糖以及木聚糖混合后,混合碳源的诱导能力大大提高,酶活分别较单纯乳糖提高了近1倍,单纯木聚糖条件下提高了近0.5倍。产物谱分析显示组合碳源的寡糖成分有所增加,其原因为乳糖或木聚糖为碳源时诱导的纤维素酶类降解PH105后产生大量的纤维寡糖,从而导致组合碳源诱导的酶活高于单一碳源条件下的酶活。3.分批发酵培养条件下不同碳源胞外蛋白质组学分析酶谱只跟踪了纤维素酶和木聚糖酶的变化情况,并未跟踪所有与木质纤维素降解有关蛋白质的分泌变化,因此运用orbitrip质谱技术对不同碳源条件下胞外蛋白的分泌情况及秸秆麸皮条件下胞外蛋白随时间的变化进行了分析。甘油作为基础碳源不具有诱导作用,因此以1%甘油作为对照碳源。1%乳糖、1%木聚糖、1%秸秆麸皮四种碳源条件下,秸秆麸皮为碳源的条件下纤维素降解酶类的分泌总量远高于其它叁种蛋白,乳糖和木聚糖诱导的蛋白总量相差不大,但分泌总量远小于秸秆麸皮。叁种碳源条件下酶类组成成分差距很大。乳糖主要诱导降解纤维素的酶类,如外切纤维素酶(CBH1, CBH2)和内切纤维素酶(Egl1, Egl3,Egl4, Egl5)。木聚糖为碳源的条件下,主要诱导降解半纤维素的酶类大量分泌(如木聚糖酶,乙酰木聚糖酯酶,木糖苷酶),降解纤维素的酶类分泌量很少。由于秸秆和麸皮成分最为复杂,因此降解所需的纤维素酶,半纤维素酶都有所分泌,且比较平均。秸秆麸皮为碳源条件下,胞外酶系的表达具有次序性,蛋白分泌总量随时间依次增加。在降解前期48h-72h,外切纤维素酶(CBH1, CBH2)都是主要的降解酶类且随着时间分泌量逐渐增加,且外切纤维素酶的分泌量在整个酶系中所占比列最大。到降解后期96h-120h,降解半纤维素的木聚糖酶(XYN2, XYN3)、乙酰木聚糖酶酯酶、木葡聚糖酶的分泌量逐渐增加。由此可见瑞氏木霉分泌的游离酶系可以渗透到纤维素的内部进行降解。降解初期伴随着少量的半纤维素降解酶的分泌,·产生大量的寡糖,继而诱导大量的半纤维素降解酶的分泌。在木质纤维素整个降解过程中,瑞氏木霉能够彻底降解纤维素,不能彻底降解半纤维素,只具备降解半纤维素骨架的木聚糖酶、木葡聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶,缺少降解半纤维素侧链所需的酶类。因此,瑞氏木霉对于木质纤维素的降解是不彻底的,通过对纤维素酶系各自转录调控因子的结合位点的分析,我们发现纤维素酶分泌量可能和其调控区结合位点的个数有关。正调控因子结合位点越多,表达量越大。(本文来源于《山东大学》期刊2014-05-17）
瑞氏木霉论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
瑞氏木霉(Trichoderma reesei)产生的纤维素酶酶系全、能分泌到细胞外,是研究得最清楚的产纤维素酶的模式菌株,但是其产生的纤维素酶还不能满足工业化转化纤维素的需要。本文从纤维素酶种类与调控、提高纤维素酶活的方法、标记基因的选择等方面概述瑞氏木霉纤维素酶,分析瑞氏木霉纤维酶研究面临的问题及对策,指出提高β?葡萄糖苷酶的产量和酶活是未来研究工作的重点之一。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
瑞氏木霉论文参考文献
[1].郑芳林,吕新星,王磊,曹艳丽,陈冠军.瑞氏木霉(Trichodermareesei)纤维素酶基因转录调控辅因子的鉴定和功能研究[C].第五届泛环渤海生物化学与分子生物学会学术交流会论文集.2015
[2].陈小玲,龙思宇,陈英,张穗生,陈东.瑞氏木霉纤维素酶研究进展[J].广西科学院学报.2015
[3].张庆.瑞氏木霉纤维素酶降解模式及其功能多样性研究[D].山东大学.2015
[4].齐飞飞,刘巍峰.瑞氏木霉纤维素外切酶CBH1N-糖基化修饰在其折迭分泌中的作用[C].2014年第七届中国模式真菌研讨会论文摘要集.2014
[5].徐金涛,刘巍峰.瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶在乳糖诱导纤维素酶基因表达过程中的作用机制研究[C].2014年第七届中国模式真菌研讨会论文摘要集.2014
[6].齐飞飞.N-糖基化修饰对瑞氏木霉纤维二糖水解酶I分泌、酶活和蛋白稳定性的影响及影响机制的研究[D].山东大学.2014
[7].徐金涛.瑞氏木霉β-葡萄糖苷酶在纤维素酶诱导表达过程中作用机制的研究[D].山东大学.2014
[8].洪玉.利用随机整合和基因置换策略在瑞氏木霉中异源表达栓菌漆酶的研究[D].山东大学.2014
[9].宫亚娟.瑞氏木霉纤维素酶基因cbh1启动子突变分析及psi因子合成酶基因的功能研究[D].山东大学.2014
[10].陈林.瑞氏木霉QM9414在不同碳源条件下动态酶谱及胞外蛋白质组学分析[D].山东大学.2014
标签：纤维素酶基因; Trichoderma; reesei; 瑞氏木霉;